Summary
Detta protokoll beskriver ett CRISPR-Cas-medierat, multianalytt syntetiskt urinbiomarkörtest som möjliggör patientnära cancerdiagnostik genom ex vivo-analys av tumörassocierade proteasaktiviteter.
Abstract
Att skapa syntetiska biomarkörer för utveckling av precisionsdiagnostik har gjort det möjligt att upptäcka sjukdomar genom signalvägar utöver de som används för traditionella biovätskemätningar. Syntetiska biomarkörer använder sig i allmänhet av rapportörer som ger läsbara signaler i biovätskan för att återspegla de biokemiska förändringarna i den lokala sjukdomsmikromiljön under sjukdomsförekomst och progression. Den farmakokinetiska koncentrationen av rapportörerna och den biokemiska förstärkningen av sjukdomssignalen är avgörande för att uppnå hög sensitivitet och specificitet i ett diagnostiskt test. Här byggs en cancerdiagnostisk plattform med hjälp av ett format av syntetiska biomarkörer: aktivitetsbaserade nanosensorer som bär kemiskt stabiliserade DNA-rapportörer som kan frigöras av avvikande proteolytiska signaturer i tumörens mikromiljö. Syntetiskt DNA som sjukdomsrapportör ger multiplexeringsförmåga genom att det används som streckkod, vilket möjliggör avläsning av flera proteolytiska signaturer samtidigt. DNA-rapportörer som släpps ut i urinen detekteras med hjälp av CRISPR-nukleaser via hybridisering med CRISPR-RNA, som i sin tur producerar en fluorescerande eller kolorimetrisk signal vid enzymaktivering. I detta protokoll konstrueras DNA-streckkodade, aktivitetsbaserade nanosensorer och deras tillämpning exemplifieras i en preklinisk musmodell av metastaserad kolorektalcancer. Detta system är mycket modifierbart enligt sjukdomsbiologin och genererar flera sjukdomssignaler samtidigt, vilket ger en omfattande förståelse av sjukdomsegenskaperna genom en minimalt invasiv process som endast kräver administrering av nanosensorer, urinuppsamling och ett papperstest som möjliggör patientnära diagnostik.
Introduction
Trots de betydande ansträngningarna för att identifiera tumörbiomarkörer som fällda proteiner och DNA, har det cancerdiagnostiska fältet ansträngts av deras låga förekomst eller snabba nedbrytning i cirkulationen. Som en kompletterande strategi representerar biokonstruerade syntetiska biomarkörer som selektivt svarar på sjukdomsegenskaper för att generera förstärkta signaler nya vägar mot korrekt och tillgänglig diagnostik 2,3. För att underlätta detektion utnyttjar dessa syntetiska biomarkörer tumörberoende aktiveringsmekanismer såsom enzymatisk amplifiering för att producera analyter med förbättrat signal-brusförhållande4. Här utnyttjas en klass av cancerassocierade enzymer, proteaser, för att aktivera injicerbara sensorer i nanoskala för att frigöra sjukdomsrapportörer som kan detekteras från biovätskor som blod eller urin 5,6. Mot bakgrund av tumörheterogeniteten möjliggör utvecklingen av en panel av proteasaktiverade sensorer multianalyttester som kombinerar olika proteasklyvningshändelser till en "sjukdomssignatur" för att bedöma cancerförekomst och progression på ett mer specifikt, multiplexerat sätt.
Proteasaktiverade syntetiska biomarkörer har utvecklats som består av peptidsubstrat konjugerade till ytan av en inert bärare7. När dessa peptider injiceras in vivo transporteras de till tumören, varpå enzymatisk klyvning av tumörproteaser frigör rapportörer i blod eller urin för detektion. Multiplexad detektion med proteasaktiverade syntetiska biomarkörer kräver att varje syntetisk biomarkör i en cocktail märks med en unik molekylär streckkod. För detta ändamål har olika tillvägagångssätt utvecklats, inklusive massstreckkoder och ligandkodade reportrar 8,9,10. Till skillnad från dessa metoder för multiplexering, som kan vara begränsade till ett fåtal olika signalmöjligheter, ger DNA-streckkodning många fler kombinationer i enlighet med den höga komplexiteten och heterogeniteten hos mänskliga sjukdomstillstånd. För att utöka multiplexiteten av syntetiska biomarkörer streckkodas sensorerna genom att märka varje rapportör med en unik DNA-sekvens för detektion via CRISPR-Cas-nukleas för att förstärka den biofluidiska signalen ex vivo. Dessa enkelsträngade DNA-streckkoder (ssDNA) är utformade för att binda till komplementära CRISPR-guide-RNA (crRNA), vilket aktiverar den målutlösta kollaterala nukleasaktiviteten hos CRISPR-Cas12a11. Denna nukleasaktivitet kan användas för att klyva en reporter-DNA-sträng som detekteras genom fluorescenskinetik eller med hjälp av pappersremsor.
Förutom molekylär amplifiering via proteaser (in vivo) och CRISPR-Cas (ex vivo) är en annan viktig designfunktion hos proteasaktiverade syntetiska biomarkörer att utnyttja nanomaterialets farmakokinetik för att öka den diagnostiska signalkoncentrationen i biovätskor10. Ett tillvägagångssätt är att använda en nanopartikelbärare för att öka cirkulationstiden för ytkonjugerade peptidsubstrat. En polyetylenglykol (PEG) dendrimer väljs som en nanobärare med relativt liten hydrodynamisk diameter och multivalens för att öka leveransen till tumörer. Även om den är tillräckligt liten för att främja tumörleverans, är storleken på PEG-bäraren större än den ~5 nm stora avstängningen av njurens glomerulära filtreringsbarriär så att endast klyvda peptidsubstrat kan rensas ut i urinen, vilket drar nytta av storleksfiltrering av njurarna12. I detta protokoll beskrivs flerstegsarbetsflödet för syntes och tillämpning av DNA-streckkodade aktivitetsbaserade nanosensorer i en preklinisk murin modell, vilket belyser upplägget av CRISPR-Cas-medierat, multianalyt syntetiskt urinbiomarkörtest, som har använts av denna grupp för att klassificera sjukdomsstatus i murina modeller av flera cancertyper13. Tack vare den mångsidiga designprincipen kan alla tre funktionella komponenterna i nanosensorn - nanobäraren (PEG-polymeren), den stimuli-responsiva modulen (proteasaktiverat substrat) och den biofluidiska reportern (DNA-streckkoden) - bytas ut exakt enligt applikationsspecifika behov, vilket möjliggör modularitet genom att skräddarsy mål- och frisättningsspecificiteterna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier är godkända av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid författarnas institution. Standardanläggningar för djurvård inklusive inhysningskammare, sterila huvar, bedövning och etisk avlivning krävs för att utföra dessa experiment på ett korrekt sätt. Alla försök utförs i enlighet med institutionella och nationella riktlinjer och övervakas av veterinärpersonal på institutionen. BALB/c-honor som används för experimenten kommer från en kommersiell källa (se materialtabell) och varierar i ålder från 6 till 8 veckor vid studiens början. Sekvenser för specialsyntetiserade DNA, crRNA, FRET-baserade peptidsubstratsonder och sensorpeptider finns i tilläggstabell 1.
1. Val av proteasaktiverat peptidsubstrat
- Samla in och förbereda vävnadsprover från frisk lung- eller lungvävnad med tumörknölar enligt en tidigare publicerad rapport13.
- Homogenisera vävnader i förkyld fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS, pH 7,4) (200 mg vävnad/ml PBS) med vävnadsdissociationsrör för automatisk dissociation av vävnader till encellssuspensioner.
- Centrifugera vävnaden vid 6 000 x g i 5 minuter vid 4 °C. Behåll supernatanten i ett nytt rör.
- Centrifugera supernatanten vid 14 000 x g i 25 minuter vid 4 °C.
- Mät proteinkoncentrationen med hjälp av bicinkoninsyra (BCA) proteinanalyskit (se materialtabell).
- Tillsätt PBS till provet för att bereda en 0,33 mg/ml lösning.
- Bedöm den proteolytiska aktiviteten genom att följa stegen nedan.
- I en 384-brunnars platta, tillsätt 5 μL, 6 μM FRET-baserade peptidsubstratsonder till varje brunn. För varje sond, utför reaktionen i tre exemplar.
OBS: FRET-baserad peptidsubstratsond innehåller en kort peptidsekvens (6-8 aminosyror, utformade för att vara specifika för ett målproteas eller en grupp av proteaser) som avslutas med ett fluorofor- och släckarpar. Två FRET-sonder beskrivs i tilläggstabell 1 som ett exempel. Hela biblioteket med sonder finns i Hao et al.13. veckor - Centrifugera brunnsplattan i 10 s vid rumstemperatur vid 180 x g för att säkerställa att sonderna är i botten av plattan.
- Tillsätt 25 μL 0,33 mg/ml vävnadsprov eller 40 μM rekombinant proteas13 till varje brunn.
OBS: Den slutliga koncentrationen av vävnadsprovet eller det rekombinanta proteaset kan behöva optimeras i enlighet med deras inneboende proteolytiska aktivitet. Till exempel kan starkt proteolytiska vävnader som tarmar kräva högre utspädningsfaktorer för att möjliggöra övervakning av initial enzymatisk klyvning. - Centrifugera brunnsplattan kort vid 180 x g (vid rumstemperatur) för att blanda sonderna och vävnadslysaten.
- Börja omedelbart detektera sondklyvning genom att mäta fluorescens med plattläsaren vid 37 °C varannan minut i 1 timme (λex: 485 nm; λem: 535 nm) för att övervaka klyvningen.
OBS: Använd lämpliga excitations- och emissionsvåglängder för specifika fluorofor- och släckarpar. I denna studie har parametrar (λex: 485 nm och λem: 535 nm) ställts in för FAM-fluoroforen. - För att analysera fluorescerande mätdata, använd Python-paketet (se materialförteckning) för enzymkinetikanalys som finns på https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Detta skript beräknar den initiala reaktionshastigheten (V0) med hjälp av lutningen på den linjära passningen av de första 8-10 initiala tidpunkterna.
- I en 384-brunnars platta, tillsätt 5 μL, 6 μM FRET-baserade peptidsubstratsonder till varje brunn. För varje sond, utför reaktionen i tre exemplar.
2. Formulering och karakterisering av sensorer
- Syntetisera konjugatet av DNA och proteasaktiverad peptid (PAP).
- Inkubera 20-mer-fosforotioerade DNA-rapportörer med 3'-DBCO-grupp (1,1 ekv., se materialtabell) med azidterminerade PAP:er med C-terminus cysteinände i 100 mM fosfatbuffert (pH 7,0) vid rumstemperatur i >4 timmar. Om den lämnas över natten, inkuberas vid 4 °C.
- Rena produkten på ett högpresterande vätskekromatografisystem (HPLC) utrustat med en kolonn som är idealisk för biomolekyler (se materialförteckning). Ställ in HPLC-gradienten så att den börjar från 5 % A-buffert (0,05 % TFA i H2O), håll den isokratisk i 20 minuter och nå 80 % B-buffert (0,05 % TFA, 99,95 % acetonitril) vid 65 min med en flödeshastighet på 0,3 ml min-1 och samla upp konjugatprodukten med retentionstid vid ~31 min.
- Validera de renade konjugaten med matrisassisterad laserdesorption/jonisering-flygtid (MALDI-TOF) masspektrometri med α-cyano-4-hydroxikanelsyra som matris14 (se materialtabell).
- Syntetisera de DNA-kodade aktivitetsbaserade nanosensorerna.
- Lös upp 2 mg multivalent PEG (40 kDa, 8-armar, se materialtabell) med maleimid-reaktiv grupp i 1 ml 100 mM fosfatbuffert (pH 7,0) och filter (cutoff: 0,2 μm).
- Tillsätt de cysteinterminerade DNA-peptidkonjugaten (2 ekv., se materialtabell) till PEG och reagera vid rumstemperatur i >4 timmar. Om den lämnas över natten, inkuberas vid 4 °C.
- Avlägsna de okonjugerade materialen med hjälp av storleksuteslutningskromatografi med en kommersiellt tillgänglig dextran-agaros-kompositmatriskolonn på en snabb proteinvätskekromatografi (FPLC) (se materialtabell). Kör prover i PBS och övervaka absorbansen vid 260 nm för DNA och 280 nm för peptid.
- Koncentrera de syntetiserade nanosensorerna med centrifugalfilterrör (MWCO = 10 kDa) enligt tillverkarens rekommenderade hastighet (se materialtabell).
- Kvantifiera koncentrationen av DNA med hjälp av ssDNA-analyskit (se materialtabell) och en plattläsare vid λex: 485 nm och λem: 535 nm. Förvara nanosensorerna vid 4 °C.
- Karakterisera de DNA-kodade aktivitetsbaserade nanosensorerna.
- Mäta den hydrodynamiska partikelstorleken hos DNA-kodade nanosensorer genom dynamisk ljusspridning (DLS).
OBS: Det förväntade storleksintervallet för nanosensorer är 15-50 nm, med en genomsnittlig storlek på 20-30 nm. Om ett begränsat storleksintervall önskas kan FPLC (i steg 2.3) användas för att isolera smalare fraktioner med olika molekylvikter. - Koncentrera nanosensorerna till 0,5 mg/ml (efter DNA-koncentration) med centrifugalfilterrör (MWCO = 10 kDa) och ladda proverna på ett kolfilmbelagt koppargaller monterat på en kryohållare. Observera morfologin med kryogen transmissionselektronmikroskopi (200 kV, förstoring på 10 000-60 000)14.
- Mäta den hydrodynamiska partikelstorleken hos DNA-kodade nanosensorer genom dynamisk ljusspridning (DLS).
3. Sensorinjektion och urinuppsamling
- Samla upp urin för baslinjemätning.
- Placera musen i en anpassad huskammare (se kompletterande figur 1) med en 96-hålars platta som bas.
- Håll fast musen och tryck försiktigt på urinblåsan för att tömma ut eventuell kvarvarande urin på plattan.
- Pipettera den uppsamlade urinen (~100-200 μL) från 96-hålsplattan till ett 1.5 ml rör efter att ha satt tillbaka musen till det normala höljet.
- Etablera preklinisk mustumörmodell.
- Inokulera 6 till 8 veckor gamla BALB/c-honmöss genom intravenös injektion med luciferasuttryckande MC26-Floc-cellinje (100 000 celler/mus) (se materialförteckning). Övervaka tumörprogression varje vecka med hjälp av ett fluorescensavbildningssystem in vivo .
OBS: Synlig tumörbörda indikerad av luminescerande signal inträffar ungefär i vecka 2 av injektion av denna speciella cellinje. Kontrollera noggrant tumörbärande djur under tumörprogressionen regelbundet.
- Inokulera 6 till 8 veckor gamla BALB/c-honmöss genom intravenös injektion med luciferasuttryckande MC26-Floc-cellinje (100 000 celler/mus) (se materialförteckning). Övervaka tumörprogression varje vecka med hjälp av ett fluorescensavbildningssystem in vivo .
- Injicera nanosensorer vid olika tidpunkter efter tumörimplantation.
- Bered en injektionslösning (högst 200 μl volym) innehållande nanosensorer i en koncentration av 1 nmol med DNA-streckkod i steril PBS.
- Injicera 200 μL sensorlösning i PBS i varje experimentmus intravenöst.
- Samla in urinprover från friska kontrollmöss och tumörbärande möss 1 timme efter sensorinjektion enligt beskrivningen i steg 1.1-1.3.
OBS: Färska urinprover kan bearbetas till DNA-streckkodsanalys direkt eller frysas omedelbart på is.
4. CRISPR-detektion av DNA-streckkoder: fluorescensbaserad
- Använd färska urinprover eller tina frysta prover på is. Centrifugera urinproverna vid 800 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Blanda reagenserna i tilläggstabell 2, tillsätt Cas12a-enzymet (se materialtabell) sist och blanda försiktigt reaktionen genom pipettering upp och ner. Inkubera reaktionen vid 37 °C i 30 minuter.
- Kör rapportörsreaktionen, som visas i tilläggstabell 3, i tre exemplar med hjälp av produkten från steg 2. Lägg till reaktionen från steg 2 sist och ta snabbt med till plattläsaren.
- Detektera LbaCas12a-aktivering genom att mäta fluorescens med en plattläsare vid 37 °C varannan minut i 3 timmar (λex: 485 nm och λem: 535 nm) för att övervaka klyvningskinetiken hos DNA-reportern.
- För att analysera fluorescerande mätdata, använd Python-paketet för enzymkinetikanalys som finns på https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Detta skript beräknar den initiala reaktionshastigheten (V0) med hjälp av lutningen på den linjära passningen av de första 8-10 initiala tidpunkterna.
5. CRISPR-detektion av DNA-streckkoder: pappersbaserad
- Centrifugera urinproverna vid 800 x g i 5 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Kör urinproverna för fluorescensbaserad och pappersbaserad CRISPR-detektion parallellt. - Blanda reagenserna i tilläggstabell 2. Inkubera vid 37 °C i 30 min.
OBS: Detta inkubationssteg är identiskt med det för den fluorescensbaserade CRISPR-detektionen. - Kör reporterreaktionen med FAM-biotinmärkt DNA-reporter för lateral flödesanalys på en pappersremsa (se materialtabell). Kombinera reagenserna i tilläggstabell 4 i en platta med 96 brunnar med produkten från steg 2. Täck med aluminiumfolie och inkubera vid 37 °C i 1 timme.
OBS: Välj den optimala inkubationstiden enligt kinetikövervakningen i realtid i den fluorescensbaserade CRISPR-detektionsanalysen som beskrivs ovan. - Tillsätt 80 μL PBS till en ny brunn på en platta med 96 brunnar. Tillsätt 20 μl prov från steg 3 till denna brunn.
- Placera en pappersremsa med lateralt flöde i varje brunn och vänta tills vätskan når toppen av remsan (<5 min). Titta efter kontroll- och/eller provbanden på pappersremsan.
- Ta en bild av den laterala flödesremsan och kvantifiera bandintensiteten med hjälp av ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nominering av proteasaktiverade peptidsubstrat
För att designa sensorer som kommer att återspegla förändringar i vävnadens proteolytiska aktivitet karakteriseras proteasaktiviteten i vävnaden först med hjälp av ett bibliotek av peptidsonder13 (figur 1). Färska och frysta vävnadsprover kan ge betydande information om den proteolytiska aktiviteten i tumörmikromiljön genom att kombinera vävnadsprover med FRET-sonder som är utformade för att detektera substratklyvning. Ett bibliotek av FRET-prober med en FAM-fluorofor och en CPQ-2-kylare inkuberas med vävnadsprover. Sonder med den största skillnaden i klyvningshastighet mellan skenvävnad och tumörvävnad, mätt med fluorescensspektrofotometri, väljs ut som peptidlänkare för användning i in vivo-nanosensorer (Figur 1A). För att bättre förstå tumörmiljöns fysiologi och effektivt jämföra proteasuttrycksprofiler med aktivitetsprofiler, kan FRET-sonderna inkuberas med rekombinanta proteaser för att associera substratklyvning med specifik proteasaktivitet, vilket visas med två exempelsonder i figur 1B.
Sensorformulering och karakterisering
Nanosensorerna består av en polymerkärna, peptider och enkelsträngade DNA-streckkoder, som visas i figur 2A. De polymera kärnorna är 40 kDa, PEG-dendrimerer som fungerar som bärare för upp till 8 peptid-DNA-konjugat (Figur 2B). Peptiderna, ~1,4 kDa, förbinder kärnan och DNA med en aminosyrasekvens som är utformad för att klyvas genom proteolytisk aktivitet. Den enkelsträngade DNA-streckkoden är 20 baspar lång, ~6,8 kDa, och kemiskt modifierad för förbättrad stabilitet in vivo. Efter konjugering renas peptid-DNA-konstruktionen via HPLC, vilket möjliggör separation av de konjugerade och fria beståndsdelarna (Figur 2C). Masspektrometrianalys indikerar att konjugatet har en molekylvikt på 8,283 kDa, vilket förväntas med tanke på de ingående molekylvikterna för peptiden och DNA-streckkoden på 1,4 kDa respektive 6,8 kDa. Peptid-DNA-konjugatet konjugeras vidare till PEG-dendrimeren. Den resulterande sensorn renas med FPLC för att avlägsna fritt peptid-DNA som uppvisar en förlängd retentionstid jämfört med de PEGylerade (Figur 2D). Sensorns storlek kan karakteriseras med hjälp av dynamisk ljusspridning och kryogen transmissionselektronmikroskopi, vilket indikerar en ökning i diameter efter peptid-DNA-tillsats till kärnan från ~8 nm till ~20 nm (Figur 2B). Variansen i partikelstorlek kan bero på flexibiliteten hos de ingående kedjorna och ett varierande antal peptid-DNA-armar konjugerade till varje PEG-dendrimer.
Preklinisk modell för murina sjukdomar
In vivo-arbete för att testa sensorerna innebär att etablera tumörer i lungorna hos BALB/c-möss, injicera nanosensorerna och samla in urin 1 timme efter sensorinjektion (Figur 3A). Ett urinprov tas också före tumörinokulering för att jämföra med prover efter sjukdomsinduktion. För att bedöma sensorns effekt när det gäller att upptäcka malignitet injiceras kolorirektalcancercellinjen MC26 (MC26-Fluc) intravenöst, vilket resulterar i lungtumörknölar synliga vid in vivo luminiscensavbildning. Hematoxylin- och eosinfärgning13 avslöjar histopatologi av lungvävnaden från tumörbärande respektive skenkontrollmöss och tecken på tumörbildning 11 och 21 dagar efter injektionen, vilket indikeras av svarta pilar i figur 3B.
CRISPR-aktivering med kemiskt stabiliserat DNA
För att optimera Cas12a-aktivering via ssDNA-streckkoder och komplementär crRNA-parning har olika oligonukleotidsekvenser och längder testats. Aktivering av Cas12a bedöms genom att mäta ökningen av fluorescens över tid på grund av Cas12a-klyvning av åskådare DNA-rapportör med en FRET-parning. En ökning av klyvningshastigheten är förknippad med högre koncentrationer av kemiskt modifierad ssDNA-streckkod, vilket visas med ett representativt crRNA/streckkodspar (figur 4B). Det är viktigt att notera att ett linjärt samband mellan koncentration och aktivering, som visas i figur 4B, gör det möjligt för avläsningen att återspegla närvaron av DNA-streckkoder i urinen och indirekt återspegla proteolytisk aktivitet in vivo. Vidare kan flera olika crRNA-sekvenser, som beskrivs i tilläggstabell 1, användas för Cas12a-aktivering, vilket är avgörande för att möjliggöra multiplexering. DNA-aktivatorer har valts ut för konstruktion av in vivo-sensorer baserat på deras likhet i analysprestanda. Det kemiskt modifierade ssDNA:t som är avgörande för den syntetiska biomarkörens stabilitet in vivo uppvisade Cas12a-aktivering, i jämförelse med omodifierat dsDNA och ssDNA (Figur 4C).
Multiplexad urindetektion av kemiskt stabiliserade DNA-streckkoder
Flera crRNA-modifierade enkelsträngade DNA-aktivatorpar (ssDNA) har verifierats för deras ortogonalitet mellan olika sekvenser. Detta möjliggör samtidig avläsning i flera brunnsanalyser, som visas i figur 5A. Dessutom kan modifierade DNA-molekyler i obehandlad urin detekteras med hjälp av en kolorimetrisk avläsning på pappersremsor med lateralt flöde, som visas i figur 5B. Närvaron av det ledande "provbandet" indikerar frisättning av detekterbar FAM genom reporterklyvning efter att Cas12a utlösts av urinens DNA. När Cas12a aktiveras av DNA-aktivatorn i musurin, klyver den fluorescein (FAM)-biotin-parkopplade oligonukleotidreportern och frigör FAM-molekylen, som sedan kan detekteras på "provbandet". Oskuldserade reportrar fångas på "kontrollbandet" på grund av bindningen av biotin till streptavidin. Nanosensorer väljs ut för in vivo-experiment och konstrueras med hjälp av proteasaktiverbara peptider och distinkta DNA-streckkoder. Peptider nomineras genom ex vivo-vävnadsprofilering (Figur 1A) och DNA-streckkoder väljs baserat på liknande Cas12a-aktivering (Figur 4B).
Figur 1: Identifiering av peptidsubstrat aktiverade av dysreglerade proteaser i kolorektalcancer för sensorkonstruktion. (A) FRET-parade peptidsubstrat, var och en bestående av en peptidsekvens flankerad av en FAM-fluorofor och en CPQ-2-kylare, screenas mot rekombinanta proteolytiska enzymer eller vävnadshomogenat. (B) Representativ proteasklyvningskinetik för FRET-parade peptidsubstrat (sond 1 och 2). Figuren är hämtad från Hao et al.13. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Karakterisering av DNA-streckkodad aktivitetsbaserad nanosensor med en polymer PEG-kärna. (A) DNA-streckkodade nanosensorer består av polymera nanobärare (8-armad PEG) funktionaliserade med proteasaktiverade peptider streckkodade med oligonukleotider. (B) Dynamisk ljusspridningsanalys visar en ökning av partikelstorleken från 8,3 nm (endast PEG-kärna) och 13 nm (funktionaliserad sensor). C) HPLC-rening av peptid-DNA-konjugat. Konjugatet analyseras i masspektrometri och visar förväntad molekylvikt. (D) FPLC-rening av sensorn visar separation av funktionaliserad sensor och obundet peptid-DNA-konjugat. Figuren är hämtad från Hao et al.13. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: In vivo sjukdomsinduktion och sensoranvändning. (A) Tidslinje för longitudinell tumörövervakning med nanosensor vid olika tidpunkter under tumörutvecklingen. (B) Histologiskt lungfärgning av BALB/c-möss med CRC-lungtumörer 11 och 21 dagar efter tumörinokulering och koksaltsinjicerade Sham-kontrollmöss. Skalstapel = 200 μm. Organen fixerades, bäddades in i paraffin och färgades med hematoxylin och eosin. Studien gjordes med n = 3 möss per tidpunkt och bilder från ett representativt djur visas. Pilar indikerar tumörknölar i lungan. Figuren är hämtad från Hao et al.13. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Aktivering av Cas12a med kemiskt stabiliserade DNA-aktivatorer. (A) Aktivering av Cas12a med en representativ ssDNA-streckkod genom bindning med komplementärt crRNA resulterar i transklyvning av åskådar-DNA på ett dosberoende sätt, mätt med fluorescensintensitet via spektrofotometer. (B) Den initiala reaktionshastigheten (V0) bestäms utifrån kurvans lutning i början av en reaktion i (A) och plottas för att bestämma det linjära intervallet för analysprestanda. (C) Cas12a-aktivering genom dubbelsträngade, enkelsträngade och kemiskt modifierade DNA-aktivatorer. Figuren är hämtad från Hao et al.13. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Multiplexerad CRISPR-Cas12-medierad DNA-streckkodsavläsning med två detektionsalternativ. (A) Transklyvningshastigheter för Cas12a vid aktivering av olika modifierade ssDNA-aktivator-crRNA-par bestäms i Cas12a-fluorescerande klyvningsanalysen. Analyser utförs med urinprover som samlats in från möss som injicerats med 1 nmol modifierad ssDNA-aktivator efter 1 timmes intravenös administrering. Figuren är hämtad från Hao et al.13. (B) Pappersavläsning av urinprovsaktiverad Cas12a med kolorimetriska förändringar visas på olika ställen på pappersremsan. Det övre bandet är från klyvt FAM DNA-reporter och det nedre bandet är från obruten FAM-biotinreporter. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Urinuppsamlingskammare som ska placeras över en platta med 96 brunnar. Musen placeras tillfälligt inuti cylindern för urinering i 96-hålsplattan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 1: Oligo- och peptidsekvenser för sensorformulering och CRISPR-analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 2: Reagenser för fluorescensbaserad och pappersbaserad Cas12a och urinprovsreaktion. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 3: Reagenser för reporterreaktion för fluorescensbaserad CRISPR-detektion. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell 4: Reagenser för reporterreaktion för pappersbaserad CRISPR-detektion. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenteras en mycket anpassningsbar plattform för multiplexerad cancerdetektion med ett bärbart urintest som bedömer sjukdomsassocierad proteolytisk aktivitet med hjälp av en minimalt invasiv injicerad sensor. När det aktiveras av tumörproteaser förstärks klyvningen av peptidsubstrat via DNA-streckkodsfrisättning i urinen. De syntetiska DNA-rapportörerna i ett urinprov kan avläsas genom en sekundär CRISPR-Cas-medierad enzymatisk amplifiering med hjälp av fluorometrisk detektion eller ett enkelt pappersbaserat test. DNA-streckkodning är en attraktiv metod för att märka syntetiska biomarkörer för att ge multiplexitet. Att förbättra stabiliteten hos DNA-streckkoderna genom kemisk modifiering är absolut nödvändigt för att upprätthålla nanosensorernas stabilitet in vivo. Specifikt kan DNA-streckkodsdetektion via CRISPR-Cas12a aktiveras med hjälp av helt fosforotioatmodifierade DNA-streckkoder med en stabiliserad ryggrad. Den kemiska modifieringen minskar dock hastigheten på CRISPR-Cas12a-aktiveringen i förhållande till dess ursprungliga DNA-motsvarighet, på grund av dess ökade stabilitet. Vidare kan insättning av terminala modifieringar av crRNA eller testning av olika modifierade oligonukleotider i DNA-streckkoderna ytterligare öka känsligheten för den CRISPR-medierade DNA-streckkodsdetektionen15, och därigenom förbättra detektionsgränsen (LOD) för cancerdiagnostik.
Förutom molekylär amplifiering är en annan viktig strategi för att uppnå den LOD som krävs för tidig upptäckt av cancer att dra nytta av storleksfiltrering av njurarna för att koncentrera de syntetiska DNA-rapportörerna i urinen. För detta ändamål är det viktigt att optimera storleken på DNA-streckkoderna. 20-mer crRNA-komplementära DNA uppvisade optimal CRISPR-Cas12a-medierad DNA-streckkodsavläsning från urinproverna. Denna optimala längd kan skilja sig åt när den tillämpas på olika CRISPR-nukleaser eller prekliniska djurmodeller.
För att bibehålla reproducerbarheten av detta detektionssystem är det viktigt att genomföra en grundlig karakterisering av de injicerbara nanosensorerna för att minimera batch-till-batch-variation. Variation i antalet peptid-DNA-konjugat per kärna kommer att förändra mängden DNA-streckkoder som släpps ut i urinen och därför påverka den slutliga avläsningen. På samma sätt kommer försiktig injektion av sensorn intravenöst att bidra till en konsekvent dosering av sensorn. För att säkerställa lämplig urinuppsamling av minst 50 μL urinvolym från varje djur vid en given tidpunkt är det viktigt att upprätthålla tumörbärande djurhydrering. Detta kan stödjas genom att hålla mössen på icke-vätande vattengel eller injicera PBS subkutant en timme före urinuppsamling16.
Tidpunkten för urinuppsamlingen och varaktigheten av CRISPR-Cas-medierad DNA-streckkodsavläsning är kritiska faktorer för analyskonsistens. Streckkoder i omlopp genomgår karakteristisk enkelexponentiell koncentrationsminskning efter intravenös injektion och storleksberoende njurfiltrering från blodet, med en topp 1 timme efter administrering i musmodeller13. Denna tidpunkt kan variera i en annan djurmodell. För de två avläsningsformaten för CRISPR-Cas-aktiveringsanalyser (fluorescerande vs. pappersbaserad lateral flödesanalys) är det viktigt att spåra den fluorescensbaserade kinetiken före det laterala flödet, vilket möjliggör den optimala slutpunkten för att läsa CRISPR-Cas-klyvningsprodukten.
Detta tillvägagångssätt är fördelaktigt på grund av införlivandet av dubbla signalförstärkningssteg från proteolytisk och CRISPR-Cas-medierad enzymatisk aktivering, och multiplexeringsförmågan för att fånga komplexiteten i sjukdomen. Att utöka sensorernas multiplexitet kommer att kräva noggrann materialdosering samt att utöka genomströmningen av avläsningen för att bibehålla portabilitet och användarvänlighet. Denna strategi kräver en grundlig karakterisering av proteasaktivitet i flera modeller och specificiteten hos den proteolytiska profilen mot en viss sjukdom eller sjukdomsstadium. Vidare, även om sensorinjektion är mindre invasiv än många av de diagnostiska alternativen såsom biopsi, kan intravenös injektion förlita sig på utbildade flebotomister för sensoradministrering, vilket potentiellt begränsar användningsfallet till sjukdomsövervakning snarare än initial upptäckt i en klinisk miljö. Förutom systemisk injektion kan de DNA-streckkodade nanosensorerna vidarekonstrueras med formuleringar som kan appliceras via icke-invasiv oral, inhalerad och topikal tillförsel, för att möjliggöra portabel sjukdomsdetektering och enkel självövervakning av sjukdomsprogression och behandlingsbedömning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.N.B., L.H. och R.T.Z. är listade som uppfinnare i en patentansökan relaterad till innehållet i detta arbete. S.N.B. äger aktier i Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio och är styrelseledamot i Vertex; konsulterar för Moderna och får sponsrad forskningsfinansiering från Johnson & Johnson, Revitope och Owlstone.
Acknowledgments
Denna studie stöddes delvis av ett Koch Institute Support Grant nummer P30-CA14051 från National Cancer Institute (Swanson Biotechnology Center), ett Core Center Grant P30-ES002109 från National Institute of Environmental Health Sciences, Koch Institute's Marble Center for Cancer Nanomedicine, Koch Institute Frontier Research Program via Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund, och Virginia och D. K. Ludwig Fund for Cancer Research. A.E.V.H. stöds av ett NIH-finansierat predoctoral training fellowship (T32GM130546). S.N.B. är utredare vid Howard Hughes Medical Institute. L.H. stöds av en K99/R00 Pathway to Independence Award från National Cancer Institute och startfinansiering från Boston University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
| 20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
| Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
| ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
| Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
| Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
| crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
| Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
| Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
| Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
| EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
| Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
| HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
| MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
| multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
| Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
| Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
| ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
| Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
| ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |
References
- Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring. Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).
- Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities. ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).
- Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).
- Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. Harnessing protease activity to improve cancer care. Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).
- Hanahan, D.
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Kwong, G. A., et al. Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection. Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).
- Kirkpatrick, J. D., et al. Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling. Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262 (2020).
- Warren, A. D., et al. Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers. J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).
- Kwong, G. A., et al. Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease. Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).
- Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
- Choi, H. S., et al.
- Hao, L., et al. CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics. Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).
- Hao, L., et al.
- Ghanta, K. S., et al. 5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing. Elife. 10, e72216 (2021).
- Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. Dehydration parameters and standards for laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).
