Summary
Este protocolo descreve um teste de biomarcador sintético de urina multianalito mediado por CRISPR-Cas que permite o diagnóstico de câncer no ponto de atendimento por meio da análise ex vivo das atividades de protease associadas ao tumor.
Abstract
A criação de biomarcadores sintéticos para o desenvolvimento de diagnósticos de precisão permitiu a detecção de doenças por vias além daquelas usadas para medições tradicionais de biofluidos. Os biomarcadores sintéticos geralmente fazem uso de repórteres que fornecem sinais legíveis no biofluido para refletir as alterações bioquímicas no microambiente local da doença durante a incidência e progressão da doença. A concentração farmacocinética dos repórteres e a amplificação bioquímica do sinal da doença são primordiais para alcançar alta sensibilidade e especificidade em um teste diagnóstico. Aqui, uma plataforma de diagnóstico de câncer é construída usando um formato de biomarcadores sintéticos: nanossensores baseados em atividade carregando repórteres de DNA quimicamente estabilizados que podem ser liberados por assinaturas proteolíticas aberrantes no microambiente tumoral. O DNA sintético como um repórter de doenças oferece capacidade de multiplexação por meio de seu uso como código de barras, permitindo a leitura de várias assinaturas proteolíticas de uma só vez. Os repórteres de DNA liberados na urina são detectados usando nucleases CRISPR via hibridização com RNAs CRISPR, que por sua vez produzem um sinal fluorescente ou colorimétrico após a ativação enzimática. Neste protocolo, nanosensores baseados em atividade e com código de barras de DNA são construídos e sua aplicação é exemplificada em um modelo pré-clínico de câncer colorretal metastático em camundongos. Esse sistema é altamente modificável de acordo com a biologia da doença e gera múltiplos sinais da doença simultaneamente, proporcionando uma compreensão abrangente das características da doença por meio de um processo minimamente invasivo que requer apenas administração de nanosensores, coleta de urina e um teste em papel que permite diagnósticos no ponto de atendimento.
Introduction
Apesar do esforço significativo para identificar biomarcadores tumorais, como proteínas excretadas e DNA, o campo diagnóstico do câncer tem sido tenso por sua baixa abundância ou rápida degradação na circulação1. Como estratégia complementar, biomarcadores sintéticos bioprojetados que respondem seletivamente às características da doença para gerar sinais amplificados representam novos caminhos para diagnósticos precisos e acessíveis 2,3. Para auxiliar na detecção, esses biomarcadores sintéticos aproveitam mecanismos de ativação dependentes do tumor, como a amplificação enzimática, para produzir analitos com melhor relação sinal-ruído4. Nesse estudo, uma classe de enzimas associadas ao câncer, as proteases, são aproveitadas para ativar sensores injetáveis em nanoescala para liberar repórteres de doenças detectáveis a partir de biofluidos, como sangue ou urina 5,6. À luz da heterogeneidade tumoral, o desenvolvimento de um painel de sensores ativados por protease permite testes multianalitos que combinam diferentes eventos de clivagem de protease em uma "assinatura da doença" para avaliar a incidência e a progressão do câncer de uma maneira mais específica e multiplexada.
Biomarcadores sintéticos ativados por proteases têm sido desenvolvidos que compreendem substratos peptídicos conjugados à superfície de um transportador inerte7. Quando injetados in vivo, esses peptídeos são transportados para o tumor, quando a clivagem enzimática por proteases tumorais libera repórteres no sangue ou na urina para detecção. A detecção multiplexada com biomarcadores sintéticos ativados por protease requer que cada biomarcador sintético dentro de um coquetel seja rotulado com um código de barras molecular exclusivo. Para tanto, várias abordagens têm sido desenvolvidas, incluindo códigos de barras massivos e repórteres codificados por ligantes 8,9,10. Ao contrário desses métodos de multiplexação, que podem ser limitados a algumas possibilidades diferentes de sinal, o código de barras de DNA oferece muito mais combinações de acordo com a alta complexidade e heterogeneidade dos estados de doença humana. Para expandir a multiplexidade dos biomarcadores sintéticos, os sensores são codificados por código de barras marcando cada repórter com uma sequência de DNA única para detecção via nuclease CRISPR-Cas para amplificar o sinal biofluídico ex vivo. Esses códigos de barras de DNA de fita simples (ssDNA) são projetados para se ligar a RNAs guia CRISPR complementares (crRNAs), ativando a atividade de nuclease colateral desencadeada por alvo de CRISPR-Cas12a11. Essa atividade de nuclease pode ser empregada para clivar uma fita de DNA repórter detectada através de cinética de fluorescência ou usando tiras de papel.
Além da amplificação molecular via proteases (in vivo) e CRISPR-Cas (ex vivo), outra característica chave do projeto de biomarcadores sintéticos ativados por proteases envolve o aproveitamento da farmacocinética de nanomateriais para aumentar a concentração do sinal diagnóstico em biofluidos10. Uma abordagem é o uso de um carreador de nanopartículas para aumentar o tempo de circulação de substratos peptídicos conjugados à superfície. Um dendrímero de polietilenoglicol (PEG) é selecionado como um nanocarreador com diâmetro hidrodinâmico relativamente pequeno e multivalência para aumentar a entrega aos tumores. Embora pequeno o suficiente para promover a liberação tumoral, o tamanho do carreador de PEG é maior do que o ponto de corte de ~5 nm da barreira de filtração glomerular renal, de modo que apenas substratos peptídicos clivados podem ser limpos na urina, aproveitando a filtração de tamanho pelos rins12. Neste protocolo, o fluxo de trabalho de múltiplas etapas é delineado para a síntese e aplicação de nanosensores baseados em atividade com código de barras de DNA em um modelo murino pré-clínico, destacando a configuração do teste de biomarcador sintético de urina multianalito mediado por CRISPR-Cas, que tem sido empregado por esse grupo para classificar o status da doença em modelos murinos de múltiplos tipos de câncer13. Devido ao princípio de design versátil, todos os três componentes funcionais do nanosensor - o nanocarreador (polímero PEG), o módulo responsivo a estímulos (substrato ativado por protease) e o repórter biofluídico (código de barras de DNA) - podem ser trocados com precisão de acordo com as necessidades específicas da aplicação, permitindo a modularidade adaptando as especificidades do alvo e da liberação.
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Protocol
Todos os estudos em animais são aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da instituição dos autores. Instalações padrão de cuidados com animais, incluindo câmaras de alojamento, capuzes estéreis, anestesia e eutanásia ética são necessárias para realizar adequadamente esses experimentos. Todos os experimentos são conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais e nacionais e supervisionados pela equipe veterinária da instituição. Camundongos BALB/c fêmeas, usados para os experimentos, são obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais) e variaram em idade de 6 a 8 semanas no início do estudo. Sequências para DNA sintetizado sob medida, crRNA, sondas de substrato peptídico baseadas em FRET e peptídeos sensores são fornecidas na Tabela Suplementar 1.
1. Seleção de substratos peptídicos ativados por protease
- Coletar e preparar amostras de tecido de pulmão normal ou tecido pulmonar com nódulos tumorais após relato publicadoanteriormente13.
- Homogeneizar tecidos em solução salina tamponada com fosfato pré-refrigerada (PBS, pH 7,4) (200 mg tecido/mL PBS) com tubos de dissociação tecidual para a dissociação automatizada de tecidos em suspensões unicelulares.
- O tecido da centrífuga homogeneiza a 6.000 x g por 5 min a 4 °C. Retenha o sobrenadante em um novo tubo.
- Centrifugar o sobrenadante a 14.000 x g durante 25 min a 4 °C.
- Medir a concentração de proteínas utilizando o kit de ensaio proteico de ácido bicinconínico (BCA) (ver Tabela de Materiais).
- Adicionar PBS à amostra para preparar uma solução de 0,33 mg/ml.
- Avalie a atividade proteolítica seguindo as etapas abaixo.
- Em uma placa de 384 poços, adicione sondas de substrato peptídico à base de FRET de 5 μL e 6 μM a cada poço. Para cada sonda, realizar a reação em triplicata.
NOTA: A sonda de substrato peptídico à base de FRET contém uma sequência peptídica curta (6-8 aminoácidos, projetada para ser específica para uma protease alvo ou grupo de proteases) terminada com um par de fluoróforo e quencher. Duas sondas FRET são descritas na Tabela Suplementar 1 como exemplo. A biblioteca completa de sondas pode ser encontrada em Hao et al.13º. - Centrifugar a placa do poço por 10 s à temperatura ambiente a 180 x g para garantir que as sondas estejam na parte inferior da placa.
- Adicionar 25 μL 0,33 mg/mL de amostra de tecido ou 40 μM de proteaserecombinante 13 a cada poço.
NOTA: A concentração final da amostra de tecido ou protease recombinante pode precisar ser otimizada de acordo com sua atividade proteolítica intrínseca. Por exemplo, tecidos altamente proteolíticos, como intestinos, podem exigir fatores de diluição mais altos para permitir o monitoramento da clivagem enzimática inicial. - Centrifugar brevemente a placa do poço a 180 x g (à temperatura ambiente) para misturar as sondas e os lisados teciduais.
- Comece imediatamente a detectar a clivagem da sonda medindo a fluorescência com o leitor de placas a 37 °C a cada 2 min por 1 h (λex: 485 nm; λem: 535 nm) para monitorar a clivagem.
NOTA: Use os comprimentos de onda de excitação e emissão apropriados para pares específicos de fluoróforos e quencher. No caso deste estudo, os parâmetros (λex: 485 nm e λem: 535 nm) são definidos para o fluoróforo FAM. - Para analisar os dados de medição fluorescente, utilize o pacote Python (consulte Tabela de Materiais) para análise de cinética enzimática disponível em https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Este script calcula a velocidade de reação inicial (V0) usando a inclinação do ajuste linear dos primeiros 8-10 pontos de tempo iniciais.
- Em uma placa de 384 poços, adicione sondas de substrato peptídico à base de FRET de 5 μL e 6 μM a cada poço. Para cada sonda, realizar a reação em triplicata.
2. Formulação e caracterização do sensor
- Sintetizar o conjugado de DNA e peptídeo ativado por protease (PAP).
- Incubar repórteres de DNA fosforotiotado de 20 mers com grupo 3'-DBCO (1,1 eq., ver Tabela de Materiais) com PAPs terminados com azida com terminação C-terminus cisteína em tampão fosfato 100 mM (pH 7,0) à temperatura ambiente por >4 h. Se sair durante a noite, incubar a 4 °C.
- Purificar o produto num sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) equipado com uma coluna ideal para biomoléculas (ver Tabela de Materiais). Ajuste o gradiente de HPLC para iniciar a partir de tampão A a 5% (TFA 0,05% em H2O), manter isocrático por 20 min e atingir tampão B 80% (TFA 0,05%, acetonitrila 99,95%) em 65 min com fluxo de 0,3 mL min-1, e coletar o produto conjugado com tempo de retenção em ~31 min.
- Validar os conjugados purificados por espectrometria de massa MALDI-TOF (dessorção/ionização-tempo de voo assistida por matriz) usando ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico como matriz14 (ver Tabela de Materiais).
- Sintetizar os nanosensores baseados em atividade codificados por DNA.
- Dissolver 2 mg de PEG multivalente (40 kDa, 8 braços, ver Tabela de Materiais) com grupo maleimida-reactivo em 1 ml de tampão fosfato 100 mM (pH 7,0) e filtro (ponto de corte: 0,2 μm).
- Adicione os conjugados DNA-peptídeo terminados com cisteína (2 eq., ver Tabela de Materiais) ao PEG e reaja à temperatura ambiente por >4 h. Se sair durante a noite, incubar a 4 °C.
- Remova os materiais não conjugados usando cromatografia de exclusão de tamanho com uma coluna de matriz composta de dextran-agarose comercialmente disponível em uma cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) (ver Tabela de Materiais). Executar amostras em PBS e monitorar a absorbância a 260 nm para DNA e 280 nm para peptídeo.
- Concentrar os nanosensores sintetizados com tubos filtrantes centrífugos (MWCO = 10 kDa) de acordo com a velocidade recomendada pelo fabricante (ver Tabela de Materiais).
- Quantificar a concentração de ADN utilizando o kit de ensaio ssDNA (ver Tabela de Materiais) e um leitor de placas em λex: 485 nm e λem: 535 nm. Conservar os nanosensores a 4 °C.
- Caracterizar os nanosensores baseados em atividade codificados por DNA.
- Medir o tamanho hidrodinâmico de partículas de nanosensores codificados por DNA por espalhamento dinâmico de luz (DLS).
NOTA: A faixa de tamanho esperada dos nanosensores é de 15-50 nm, com um tamanho médio de 20-30 nm. Se uma faixa de tamanho limitada for desejada, a FPLC (na etapa 2.3) pode ser usada para isolar frações mais estreitas com pesos moleculares diferentes. - Concentrar os nanosensores a 0,5 mg/mL (por concentração de DNA) com tubos filtrantes centrífugos (MWCO = 10 kDa) e carregar as amostras em uma grade de cobre revestida por filme de carbono montada em um criosuporte. Observar a morfologia por microscopia eletrônica de transmissão criogênica (200 kV, aumento de 10.000-60.000)14.
- Medir o tamanho hidrodinâmico de partículas de nanosensores codificados por DNA por espalhamento dinâmico de luz (DLS).
3. Injeção do sensor e coleta de urina
- Coletar urina para medição basal.
- Coloque o mouse em uma câmara de alojamento personalizada (consulte a Figura Suplementar 1) com uma placa de 96 poços como base.
- Restrinja o rato e aplique uma pressão suave na bexiga para urinar qualquer urina restante na placa.
- Pipetar a urina coletada (~100-200 μL) da placa de 96 poços para um tubo de 1,5 mL após substituir o mouse para o alojamento normal.
- Estabelecer modelo pré-clínico de tumor murino.
- Inocular camundongos fêmeas BALB/c de 6 a 8 semanas de idade por injeção intravenosa com linhagem celular MC26-Fluc que expressa luciferase (100k células/camundongo) (ver Tabela de Materiais). Monitorar a progressão tumoral semanalmente usando um sistema de imagem de fluorescência in vivo .
NOTA: A carga tumoral visível indicada pelo sinal luminescente ocorre aproximadamente na semana 2 de injeção desta linhagem celular em particular. Verifique cuidadosamente os animais portadores de tumor durante a progressão do tumor regularmente.
- Inocular camundongos fêmeas BALB/c de 6 a 8 semanas de idade por injeção intravenosa com linhagem celular MC26-Fluc que expressa luciferase (100k células/camundongo) (ver Tabela de Materiais). Monitorar a progressão tumoral semanalmente usando um sistema de imagem de fluorescência in vivo .
- Injetar nanosensores em diferentes momentos após a implantação do tumor.
- Preparar uma solução de injeção (volume máximo de 200 μL) contendo nanosensores a uma concentração de 1 nmol por código de barras de DNA em PBS estéril.
- Injetar 200 μL de solução sensorial em PBS em cada camundongo experimental por via intravenosa.
- Coletar amostras de urina de camundongos controles saudáveis e portadores de tumor em 1 h após a injeção do sensor, conforme descrito nas etapas 1.1-1.3.
NOTA: Amostras de urina fresca podem ser processadas para análise de código de barras de DNA diretamente ou congeladas imediatamente no gelo.
4. Detecção CRISPR de códigos de barras de DNA: baseado em fluorescência
- Use amostras de urina fresca ou descongele amostras congeladas no gelo. Centrifugar amostras de urina a 800 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
- Combinar os reagentes do Quadro Suplementar 2, adicionar a enzima Cas12a (ver Tabela de Materiais) por último e misturar suavemente a reacção pipetando para cima e para baixo. Incubar a reação a 37 °C por 30 min.
- Execute a reação do repórter, como mostrado na Tabela Suplementar 3, em triplicata usando o produto da etapa 2. Adicione a reação do Passo 2 por último e leve rapidamente ao leitor de placas.
- Detectar a ativação de LbaCas12a medindo fluorescência com um leitor de placas a 37 °C a cada 2 min por 3 h (λex: 485 nm e λem: 535 nm) para monitorar a cinética de clivagem do repórter de DNA.
- Para analisar os dados de medição fluorescente, utilize o pacote Python para análise de cinética enzimática disponível em https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Este script calcula a velocidade de reação inicial (V0) usando a inclinação do ajuste linear dos primeiros 8-10 pontos de tempo iniciais.
5. Detecção CRISPR de códigos de barras de DNA: baseado em papel
- Centrifugar amostras de urina a 800 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
NOTA: Execute as amostras de urina para detecção CRISPR baseada em fluorescência e em papel em paralelo. - Combinar os reagentes na Tabela Suplementar 2. Incubar a 37 °C durante 30 min.
NOTA: Esta etapa de incubação é idêntica à da detecção CRISPR baseada em fluorescência. - Execute a reação do repórter usando o repórter de DNA marcado com biotina FAM para o ensaio de fluxo lateral em uma tira de papel (consulte a Tabela de Materiais). Combinar os reagentes da Tabela Suplementar 4 em uma placa de 96 poços usando o produto da etapa 2. Cubra com papel alumínio e incube a 37 °C por 1 h.
NOTA: Selecione o tempo de incubação ideal de acordo com o monitoramento cinético em tempo real no ensaio de detecção CRISPR baseado em fluorescência descrito acima. - Para um poço fresco de uma placa de 96 poços, adicione 80 μL de PBS. Adicionar 20 μL de amostra do passo 3 a este poço.
- Coloque uma tira de papel de fluxo lateral em cada poço e aguarde até que o líquido atinja o topo da tira (<5 min). Procure a aparência da(s) faixa(s) de controle e/ou amostra(s) na tira de papel.
- Tire uma foto da faixa de fluxo lateral e quantifique a intensidade da banda usando o ImageJ.
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Representative Results
Nomeação de substratos peptídicos ativados por protease
Para projetar sensores que reflitam mudanças na atividade proteolítica do tecido, primeiramente caracteriza-se a atividade de proteases no tecido por meio de uma biblioteca de sondas peptídicas13 (Figura 1). Amostras de tecido fresco e congelado podem fornecer informações substanciais sobre a atividade proteolítica do microambiente tumoral combinando amostras de tecido com sondas FRET projetadas para detectar a clivagem do substrato. Uma biblioteca de sondas FRET com um fluoróforo FAM e um quencher CPQ-2 é incubada com amostras de tecido. Sondas com a maior diferença na taxa de clivagem entre tecido sham e tecido tumoral, medida por espectrofotometria de fluorescência, são selecionadas como ligantes peptídicas para uso nos nanosensores in vivo (Figura 1A). Para melhor compreender a fisiologia do ambiente tumoral e comparar efetivamente os perfis de expressão de proteases com os perfis de atividade, as sondas FRET podem ser incubadas com proteases recombinantes para associar a clivagem do substrato com a atividade específica da protease, como demonstrado com dois exemplos de sondas na Figura 1B.
Formulação e caracterização de sensores
Os nanosensores são compostos por um núcleo polimérico, peptídeos e códigos de barras de DNA de fita simples, conforme ilustrado na Figura 2A. Os núcleos poliméricos são dendrímeros de 40 kDa, PEG, que atuam como carreadores de até 8 conjugados peptídeo-DNA (Figura 2B). Os peptídeos, ~1,4 kDa, conectam o núcleo e o DNA com uma sequência de aminoácidos projetada para ser clivada através da atividade proteolítica. O código de barras de DNA de fita simples tem 20 pares de bases de comprimento, ~6,8 kDa, e é quimicamente modificado para melhorar a estabilidade in vivo. Após a conjugação, a construção peptídeo-DNA é purificada via HPLC, permitindo a separação dos constituintes conjugados e livres (Figura 2C). A análise por espectrometria de massas indica que o conjugado tem um peso molecular de 8,283 kDa, o que é esperado considerando os pesos moleculares constituintes para o peptídeo e o código de barras de DNA de 1,4 kDa e 6,8 kDa, respectivamente. O conjugado peptídeo-DNA é ainda conjugado ao dendrímero PEG. O sensor resultante é purificado usando FPLC para remover peptídeo-DNA livre, que exibe um tempo de retenção prolongado em comparação com os PEGylated (Figura 2D). O tamanho do sensor pode ser caracterizado através de espalhamento dinâmico de luz e microscopia eletrônica de transmissão criogênica, que indicam um aumento no diâmetro após a adição de peptídeo-DNA ao núcleo de ~8 nm para ~20 nm (Figura 2B). A variância no tamanho das partículas pode ser devida à flexibilidade das cadeias constituintes e a um número variável de braços peptídeo-DNA conjugados a cada dendrímero PEG.
Modelo pré-clínico de doença murina
O trabalho in vivo para testar os sensores envolve estabelecer tumores por 3 semanas nos pulmões de camundongos BALB/c, injetar os nanosensores e coletar urina 1 h após a injeção do sensor (Figura 3A). Uma amostra de urina basal também é colhida antes da inoculação do tumor para comparar com amostras após a indução da doença. A fim de avaliar a eficácia do sensor na detecção de malignidade, a linhagem celular de câncer colorretal MC26 (MC26-Fluc) com expressão de luciferase é injetada por via intravenosa, resultando em nódulos tumorais de pulmão visíveis em imagens de luminescência in vivo . A coloração pela hematoxilina e eosina13 revela histopatologia do tecido pulmonar de camundongos portadores e sham controle, respectivamente, e evidência de formação tumoral aos 11 e 21 dias pós-injeção, como indicado pelas setas pretas na Figura 3B.
Ativação de CRISPR por DNA quimicamente estabilizado
Para otimizar a ativação de Cas12a via códigos de barras ssDNA e emparelhamento complementar de crRNA, diferentes sequências e comprimentos de oligonucleotídeos foram testados. A ativação de Cas12a é avaliada medindo-se o aumento da fluorescência ao longo do tempo devido à clivagem de Cas12a do repórter de DNA do espectador com um emparelhamento FET. Um aumento na taxa de clivagem está associado a maiores concentrações de código de barras ssDNA quimicamente modificado, como mostrado com um par representativo de crRNA/código de barras (Figura 4B). É importante ressaltar que uma relação linear entre concentração e ativação, como mostrado na Figura 4B, permite que a leitura seja reflexo da presença de DNA barcode na urina e indiretamente reflexo da atividade proteolítica in vivo. Além disso, várias sequências diferentes de crRNA, conforme detalhado na Tabela Suplementar 1, podem ser usadas para ativação de Cas12a, o que é crítico para permitir a multiplexação. Ativadores de DNA foram selecionados para a construção de sensores in vivo com base em sua similaridade no desempenho do ensaio. O ssDNA quimicamente modificado, crítico para a estabilidade in vivo do biomarcador sintético, demonstrou ativação de Cas12a, em comparação com dsDNA e ssDNA não modificados (Figura 4C).
Detecção urinária multiplexada de códigos de barras de DNA quimicamente estabilizados
Múltiplos pares de ativadores de DNA de fita simples modificados por crRNA (ssDNA) foram verificados quanto à sua ortogonalidade entre diferentes sequências. Isso permite a leitura simultânea em vários ensaios de poço, conforme ilustrado na Figura 5A. Além disso, moléculas de DNA modificadas na urina não processada podem ser detectadas usando uma leitura colorimétrica em tiras de papel de fluxo lateral, como mostrado na Figura 5B. A presença da "banda amostral" principal indica a liberação de FAM detectável através da clivagem do repórter após Cas12a ser desencadeada pelo DNA urinário. Quando o Cas12a é ativado pelo ativador de DNA na urina de camundongos, ele cliva o repórter de oligonucleotídeos emparelhado com fluoresceína (FAM) e biotina, liberando a molécula de FAM, que é então detectável na "banda de amostra". Os repórteres são capturados na "banda de controle" devido à ligação da biotina à estreptavidina. Nanosensores são selecionados para experimentos in vivo e construídos usando peptídeos ativadores de protease e códigos de barras de DNA distintos. Os peptídeos são nomeados através de perfis teciduais ex vivo (Figura 1A) e os códigos de barras de DNA são selecionados com base na ativação semelhante de Cas12a (Figura 4B).
Figura 1: Identificação de substratos peptídicos ativados por proteases desreguladas em câncer colorretal para construção de sensores. (A) Substratos peptídicos emparelhados com FRET, cada um consistindo de uma sequência peptídica flanqueada por um fluoróforo FAM e um quencher CPQ-2, são rastreados contra enzimas proteolíticas recombinantes ou homogeneizados de tecido. (B) Cinética representativa de clivagem de proteases de substratos peptídicos pareados com FRET (Sonda 1 & 2). A figura é adaptada de Hao et al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Caracterização de nanossensores baseados em atividade com código de barras de DNA com núcleo de PEG polimérico. (A) Os nanosensores com código de barras de DNA compreendem nanocarreadores poliméricos (PEG de 8 braços) funcionalizados com peptídeos ativados por protease com código de barras com oligonucleotídeos. (B) A análise dinâmica de espalhamento de luz mostra um aumento do tamanho das partículas de 8,3 nm (núcleo de PEG apenas) e 13 nm (sensor funcionalizado). (C) purificação por HPLC do conjugado peptídeo-DNA. O conjugado é analisado em espectrometria de massas e apresenta peso molecular esperado. (D) A purificação FPLC do sensor mostra a separação do sensor funcionalizado e do conjugado peptídeo-DNA ilimitado. A figura é adaptada de Hao et al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Indução da doença in vivo e utilização do sensor. (A) Linha do tempo do monitoramento longitudinal do tumor com nanosensor em diferentes momentos ao longo do desenvolvimento do tumor. (B) Coloração histológica pulmonar de camundongos BALB/c portadores de tumores pulmonares de CCR aos 11 e 21 dias após a inoculação tumoral e camundongos controle Sham injetados com solução salina. Barra de escala = 200 μm. Os órgãos foram fixados, incluídos em parafina e corados com hematoxilina e eosina. O estudo foi feito com n = 3 camundongos por ponto de tempo e imagens de um animal representativo são mostradas. As setas indicam nódulos tumorais no pulmão. A figura é adaptada de Hao et al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ativação de Cas12a por ativadores de DNA quimicamente estabilizados. (A) A ativação de Cas12a por um código de barras ssDNA representativo através da ligação com crRNA complementar resulta em transclivagem do DNA do espectador de forma dose-dependente, medida pela intensidade de fluorescência via espectrofotômetro. (B) A velocidade de reação inicial (V0) é determinada a partir da inclinação da curva no início de uma reação em (A) e plotada para determinar a faixa linear de desempenho do ensaio. (C) Ativação de Cas12a por ativadores de DNA de fita dupla, fita simples e quimicamente modificados. A figura é adaptada de Hao et al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Leitura do código de barras de DNA multiplexado CRISPR-Cas12 mediado com duas opções de detecção. (A) As taxas de transclivagem de Cas12a após a ativação de diferentes pares modificados de ssDNA activator-crRNA são determinadas no ensaio de clivagem fluorescente Cas12a. Os ensaios são realizados com amostras de urina coletadas de camundongos injetados com 1 nmol de ativador de ssDNA modificado após 1 h de administração i.v. A figura é adaptada de Hao et al.13. (B) A leitura em papel de Cas12a ativado por amostra de urina com alterações colorimétricas aparece em diferentes locais da tira de papel. A faixa superior é do repórter de DNA FAM clivado e a faixa inferior é do repórter FAM-biotina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Câmara coletora de urina para colocação sobre placa de 96 poços. O mouse é temporariamente colocado dentro do cilindro para urinar na placa de 96 poços. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela suplementar 1: Sequências de oligo e peptídeos para formulação de sensores e ensaio CRISPR. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela suplementar 2: Reagentes para reação de cas12a e amostra de urina à base de fluorescência e papel. Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela suplementar 3: Reagentes da reação do repórter para detecção CRISPR baseada em fluorescência. Clique aqui para baixar este arquivo.
Quadro suplementar 4: Reagentes da reacção do repórter para detecção CRISPR em papel. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Apresentamos aqui uma plataforma altamente personalizável para detecção de câncer multiplexado com um teste de urina portátil que avalia a atividade proteolítica associada à doença usando um sensor injetado minimamente invasivo. Quando ativada por proteases tumorais, a clivagem do substrato peptídico é amplificada via liberação de código de barras de DNA na urina. Os repórteres de DNA sintético em uma amostra de urina podem ser lidos por uma amplificação enzimática secundária mediada por CRISPR-Cas usando detecção fluorométrica ou um teste simples baseado em papel. O DNA barcoding é um método atraente para marcar biomarcadores sintéticos para proporcionar multiplexidade. Melhorar a estabilidade dos códigos de barras do DNA através de modificações químicas é imperativo para manter a estabilidade dos nanosensores in vivo. Especificamente, a detecção de código de barras de DNA via CRISPR-Cas12a pode ser ativada usando códigos de barras de DNA totalmente modificados com fosforotioato com uma espinha dorsal estabilizada. A modificação química reduz a velocidade de ativação do CRISPR-Cas12a em relação ao seu equivalente de DNA nativo, no entanto, devido à sua maior estabilidade. Além disso, inserir modificações terminais no crRNA ou testar diferentes oligonucleotídeos modificados nos códigos de barras de DNA pode aumentar ainda mais a sensibilidade da detecção de código de barras de DNA mediada por CRISPR15, melhorando assim o limite de detecção (LOD) do diagnóstico de câncer.
Além da amplificação molecular, outra estratégia chave para atingir o LOD necessário para a detecção precoce do câncer envolve aproveitar a filtração de tamanho pelos rins para concentrar os repórteres de DNA sintético na urina. Para isso, é fundamental otimizar o tamanho dos códigos de barras de DNA. DNAs complementares de crRNA de 20 meros exibiram leitura ótima do código de barras de DNA mediado por CRISPR-Cas12a das amostras de urina. Esse comprimento ótimo pode diferir quando aplicado a diferentes nucleases CRISPR ou modelos animais pré-clínicos.
Para manter a reprodutibilidade deste sistema de detecção, é importante realizar uma caracterização completa dos nanosensores injetáveis para minimizar a variação lote a lote. A variação no número de conjugados peptídeo-DNA por núcleo alterará a quantidade de códigos de barras de DNA liberados na urina e, portanto, afetará a leitura final. Da mesma forma, a injeção cuidadosa do sensor por via intravenosa ajudará na consistência na dosagem do sensor. A fim de garantir a coleta adequada de urina de pelo menos 50 μL de volume de urina de cada animal em um determinado ponto de tempo, manter a hidratação do animal portador de tumor é fundamental. Isso pode ser apoiado mantendo os camundongos em gel de água não umectante ou injetando PBS por via subcutânea uma hora antes da coleta de urina16.
O momento da coleta de urina e a duração da leitura do código de barras de DNA mediado por CRISPR-Cas são fatores críticos para a consistência do ensaio. Os códigos de barras na circulação sofrem decaimento característico da concentração monoexponencial após injeção intravenosa e filtração renal do sangue dependente do tamanho, com pico de 1 h após a administração em modelos de camundongos13. Esse ponto de tempo pode variar em um modelo animal diferente. Para os dois formatos de leitura dos ensaios de ativação CRISPR-Cas (fluorescente vs. ensaio de fluxo lateral baseado em papel), é importante rastrear a cinética baseada em fluorescência antes do fluxo lateral, permitindo o ponto final ideal para ler o produto de clivagem CRISPR-Cas.
Essa abordagem é vantajosa devido à incorporação de etapas de amplificação de sinal duplo a partir da ativação enzimática mediada por proteolítico e CRISPR-Cas, e à capacidade de multiplexação para capturar a complexidade da doença. A expansão da multiplexidade dos sensores exigirá uma dosagem cuidadosa do material, bem como a expansão do rendimento da leitura para manter a portabilidade e a facilidade de uso. Essa estratégia requer uma caracterização completa da atividade da protease em múltiplos modelos e da especificidade do perfil proteolítico para uma determinada doença ou estágio da doença. Além disso, embora a injeção do sensor seja menos invasiva do que muitas das alternativas diagnósticas, como a biópsia, a injeção intravenosa pode depender de flebotomistas treinados para a administração do sensor, potencialmente limitando o caso de uso ao monitoramento da doença em vez da detecção inicial em um ambiente clínico. Além da injeção sistêmica, os nanosensores com código de barras de DNA podem ser projetados com formulações que podem ser aplicadas por meio de entrega oral, inalatória e tópica não invasiva, para permitir a detecção portátil de doenças e fácil automonitoramento da progressão da doença e avaliação da terapia.
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Disclosures
S.N.B., L.H. e R.T.Z. estão listados como inventores em um pedido de patente relacionado ao conteúdo deste trabalho. A S.N.B. detém participação na Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio e é diretora da Vertex; presta consultoria para a Moderna e recebe financiamento de pesquisa patrocinado da Johnson & Johnson, Revitope, e Owlstone.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado em parte por uma concessão de apoio do Instituto Koch número P30-CA14051 do Instituto Nacional do Câncer (Swanson Biotechnology Center), um Core Center Grant P30-ES002109 do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental, o Centro de Mármore do Instituto Koch para Nanomedicina do Câncer, o Programa de Pesquisa de Fronteira do Instituto Koch através do Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund, e o Virginia and D. K. Ludwig Fund for Cancer Research. A A.E.V.H. é apoiada por uma bolsa de treinamento pré-doutoral (T32GM130546) financiada pelo NIH. S.N.B. é investigador do Howard Hughes Medical Institute. L.H. é apoiado por um K99/R00 Pathway to Independence Award do National Cancer Institute e pelo financiamento de startups da Universidade de Boston.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
| 20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
| Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
| ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
| Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
| Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
| crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
| Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
| Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
| Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
| EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
| Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
| HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
| Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
| MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
| multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
| Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
| Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
| ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
| Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
| ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |
References
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