Summary
Adeno-associeret virus fremstilles i suspensionscellekultur og renses ved centrifugering med dobbelt iodixanoldensitetsgradient. Trin er inkluderet for at øge det samlede virusudbytte, mindske risikoen for virusudfældning og yderligere koncentrere det endelige virusprodukt. Forventede sluttitre når op på 1012 virale partikler/ml og er egnede til præklinisk in vivo-brug .
Abstract
Denne protokol beskriver rekombinant adeno-associeret virus (rAAV) produktion og oprensning ved iodixanol densitetsgradientcentrifugering, en serotype-agnostisk metode til rensning af AAV først beskrevet i 1999. rAAV-vektorer anvendes i vid udstrækning i genterapiapplikationer til at levere transgener til forskellige humane celletyper. I dette arbejde produceres den rekombinante virus ved transfektion af Expi293-celler i suspensionskultur med plasmider, der koder for transgen-, vektorkapsid- og adenovirale hjælpergener. Iodixanol densitetsgradientcentrifugering renser fulde AAV-partikler baseret på partikeldensitet. Derudover er tre trin inkluderet i denne nu allestedsnærværende metode for at øge det samlede virusudbytte, mindske risikoen for udfældning på grund af forurenende proteiner og yderligere koncentrere det endelige virusprodukt, henholdsvis: udfældning af virale partikler fra cellemedier ved anvendelse af en opløsning af polyethylenglycol (PEG) og natriumchlorid, indførelsen af en anden runde af iodixanol densitetsgradientcentrifugering, og bufferudskiftning via et centrifugalfilter. Ved hjælp af denne metode er det muligt konsekvent at opnå titere i området 1012 virale partikler/ml af exceptionel renhed til in vivo-brug .
Introduction
Rekombinante adeno-associerede virale (rAAV) vektorer er almindeligt anvendte værktøjer til behandling af genetiske sygdomme, herunder spinal muskelatrofi, retinal dystrofi og hæmofili A 1,2,3. rAAV-vektorer er konstrueret til at mangle virale gener, der er til stede i vildtype AAV4, en lille, ikke-konvolut icosahedral virus med et lineært enkeltstrenget 4,7 kb DNA-genom. AAV blev først opdaget i 1960'erne som en forurening af adenoviruspræparater5. På trods af sin lille kapsidstørrelse, som begrænser størrelsen af transgenet, der kan pakkes til maksimalt 4,9 kb eksklusive ITR6, er AAV nyttig til transgenlevering, fordi den er ikke-patogen hos mennesker, tillader ekspression af transgen i mange delende og ikke-delende celletyper og har begrænsede immunogene virkninger7.
Som medlemmer af slægten dependoparvovirus er produktionen af rAAV'er afhængig af ekspressionen af hjælpergener, der er til stede i adenovirus eller herpes simplex virus8. Flere strategier til produktion af rAAV er blevet udviklet, men produktion i HEK293-celler transformeret med adenovirale E1A/E1B-hjælpegener er den mest etablerede metode, der anvendes i dag9. Den generelle tilgang til rAAV-produktion begynder med transfektion af HEK293-celler med tre plasmider indeholdende transgenet inden for henholdsvis inverterede terminale gentagelser (ITR'er), AAV-rep - og cap-gener og yderligere adenovirale hjælpergener. Tooghalvfjerds timer efter transfektion høstes og behandles celler for at rense rAAV indeholdende transgenet.
I udviklingen af nye rAAV-vektorer til terapeutiske formål er et vigtigt mål at producere vektorer med øget transduktionseffektivitet. En forøgelse af målcellernes transduktionseffektivitet ville betyde et fald i den nødvendige kliniske dosis rAAV, hvilket ville mindske sandsynligheden for negative immunogene virkninger, der spænder fra antistofmedieret neutralisering til akut toksicitet10,11. For at forbedre transduktionseffektiviteten af rAAV-vektorer kan der foretages ændringer i det pakkede genom eller kapsiden. Levedygtige metoder til at indstille transduktionseffektiviteten via pakket genomdesign omfatter inkorporering af stærke og vævsspecifikke promotorer, tankevækkende udvælgelse af mRNA-behandlingselementer og kodningssekvensoptimering for at forbedre oversættelseseffektiviteten12. Ændringer i kapsiden foretages med det formål at øge tropismen for målhumane celletyper. Bestræbelser på at udvikle nye rAAV-transgenleveringsvektorkapsider er generelt kendetegnet ved fokus på enten rationelt design af AAV-kapsider med specifikke mutationer rettet mod specifikke cellereceptorer eller rettet evolution for at identificere kapsider med tropisme for specifikke celletyper fra kombinatoriske capsidbiblioteker med høj kompleksitet uden at målrette mod en bestemt receptor (selvom nogle grupper kombinerer disse tilgange)13, 14,15. I den rettede evolutionstilgang konstrueres kombinatoriske capsidbiblioteker ved hjælp af en bestemt serotype-rygrad med muterede variable regioner på kapsidet ydre16. Kombinatoriske capsidbiblioteker er ofte konstrueret af AAV-serotyper, der ikke stammer fra mennesker, hvilket reducerer risikoen for allerede eksisterende immunitet under klinisk brug10. Derfor er rensningsmetoder, der kan anvendes på enhver serotype, ideelle til at eliminere behovet for serotypespecifik optimering for de mindre almindeligt anvendte serotyper, der tjener som rygrad for disse biblioteker.
Iodixanol densitetsgradientcentrifugering anvendes til at rense høje titere af rAAV med høj infektivitet17. I denne protokol produceres rAAV i suspensionscellekultur for at reducere mængden af arbejdskraft, der er nødvendig for at producere store titere af AAV. Et centrifugeringstrin er også inkluderet for at rydde cellelysat for at reducere tilstedeværelsen af forurenende proteiner og mindske risikoen for virusudfældning. Denne protokol er en omkostningseffektiv metode til fremstilling af præparater af rAAV med høj renhed, der er egnet til præklinisk brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sammensætningen af de opløsninger og buffere, der anvendes i denne protokol, er angivet i tabel 1.
| Opløsning | Sammensætning | |
| AAV lysis buffer | 1,2 ml 5 M NaCl opløsning | |
| 2 ml 1 M Tris-HCl pH 8,5 opløsning | ||
| 80 ml 1 MMgCl2-opløsning | ||
| mQ vand til 40 ml | ||
| AAV nedbør opløsning | 40 g PEG 8000 | |
| 50 ml 5 M NaCl opløsning | ||
| mQ vand til 100 ml | ||
| 15% iodixanol fraktion | 7,5 ml OptiPrep | |
| 3 ml 10X DPBS | ||
| 6 ml 5 M NaCl opløsning | ||
| 30 ml 1 MMgCl2-opløsning | ||
| mQ til 30 ml | ||
| 25% iodixanol fraktion | 12. 5 ml OptiPrep | |
| 3 ml 10X DPBS | ||
| 30 ml 1 MMgCl2-opløsning | ||
| 60 uL phenolrød opløsning | ||
| mQ til 30 ml | ||
| 40% iodixanol fraktion | 33,3 ml OptiPrep | |
| 5 ml 10X DPBS | ||
| 50 liter 1 MMgCl2 opløsning | ||
| mQ til 50 ml | ||
| 60% iodixanol fraktion | 50 ml OptiPrep | |
| 100 uL phenolrød opløsning | ||
| AAV-bufferopløsning | 8 ml 5 M NaCl | |
| 20 ml 10% Pluronic F-68 | ||
| PBS til 200 ml | ||
Tabel 1: Opløsningssammensætninger for opløsninger, der anvendes i denne protokol.
1. Tredobbelt transfektion af Expi293-celler
- Seed Expi293-celler (se materialetabel) ved en initialtæthed på 5 x 105 levedygtige celler (vc)/ml.
- Lad cellerne inkubere ved 37 °C med 8 % CO2 og en rystehastighed på 125 omdr./min., indtil de når en massefylde på 3-5 x 106 vc/ml. Overvåg celletæthed og levedygtighed ved hjælp af trypanblå udelukkelse med en automatiseret celletæller (se materialetabel).
- Når celler når den ønskede celletæthed, skal du opdele dem 1 til 10 ved at tilføje friske medier, så deres samlede volumen er ti gange deres oprindelige volumen. Overfør om nødvendigt celler til en større kolbe. Tilbage til inkubation.
- Fortsæt med at udvide cellerne som beskrevet i trin 1.2-1.3, indtil de når en massefylde på mindst 2 x 106 vc/ml i 250 ml medier i en 1 liters kolbe.
- Dagen før transfektion fortyndes cellerne til 2 x 106 vc/ml i 250 ml medier, og overskydende celler kasseres efter behov. Inkuber cellerne natten over.
- På transfektionsdagen centrifugeres halvdelen af cellerne ved 58 x g i 5 minutter ved 18 °C. Resuspender cellepillen i samme volumen (125 ml) frisk medium. Cellelevedygtigheden skal være tæt på 98%.
- Forbered to 50 ml koniske rør. Mærk den ene "PEI" og den anden "DNA".
- I det koniske rør mærket PEI fortyndes 1,2 ml PEI (polyethylenamin, se materialetabel) til et samlet volumen på 12,5 ml i OptiMEM-medier.
- I det koniske rør mærket DNA fremstilles en ækvimolær opløsning af plasmid-DNA til i alt 500 μg DNA i et samlet volumen på 12,5 ml i OptiMEM-medier.
- Tilsæt DNA-opløsningen til PEI-opløsningen, vend flere gange for grundigt at kombinere, og lad inkubere ved stuetemperatur i 10 minutter.
BEMÆRK: Det er afgørende, at DNA-PEI-opløsningen får lov til at inkubere i hele 10 minutter, for at PEI kan danne ladede komplekser med DNA'et. - Når DNA-PEI-opløsningen er inkuberet i 10 minutter, skal du bruge en serologisk pipet til langsomt at påføre DNA-PEImax-opløsningen på Expi293-cellerne. Sæt de transfekterede celler tilbage i inkubatoren og lad dem inkubere i 72 timer (figur 1).
Figur 1: Expi293-celler, der udtrykker GFP to dage efter transfektion. Efter transfektion med et plasmid indeholdende et gen for GFP udtrykker Expi293-cellerne forbigående eGFP. Cellemorfologien er rund. Billedet blev taget med en eksponeringstid på 15 ms. Mikroskopbilleder erhverves ved hjælp af et omvendt mikroskop udstyret med epifluorescensbelysning og et 10x / 0,30 mål. Skalabjælke = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. rAAV vektor oprensning
- Efter 72 timer overføres cellerne i suspension til to 250 ml koniske rør og drejes ned ved 415 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Supernatantsubstratet hældes i et friskt 500 ml konisk glas og opbevares ved 0 °C på is til senere forarbejdning.
- Hver cellepellet resuspenderes i 10 ml AAV-lysisbuffer (tabel 1). Saml de to lysater sammen i et af rørene. Skyl det andet rør med yderligere 5 ml AAV-lysisbuffer, og tilsæt det derefter til de poolede lysater. Fryses ved -70 °C.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause på dette tidspunkt. Supernatantmediet opbevares ved -70 °C i stedet for på is. - Fra trin 2.2 tilsættes 1:4 volumen AAV-nedbørsopløsning til supernatantmediet. Vend om flere gange for at blande grundigt og inkubere ved 0 °C på is i mindst 2 timer eller natten over.
- Den inkuberede opløsning centrifugeres ved 3000 x g i 1 time ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres, og pellet indeholdende virusbundfald resuspenderes i 5 ml AAV-lysisbuffer.
- Cellen skal tøs op ved 37 °C i et vandbad.
- Pool det virale bundfald med cellelysatet. Dette er det rå lysat. Skyl centrifugeringsrøret, der indeholdt det virale bundfald, med yderligere 5 ml AAV-lysisbuffer og pulje med det rå lysat.
- Det rå lysat fryses ned til -70 °C, og optø derefter ved 37 °C. Gentag denne cyklus igen.
BEMÆRK: Det rå lysat bør ikke efterlades ved 37 °C længere end nødvendigt for at tø det op. - Når det er optøet for tredje gang, tilsættes straks 4 μL benzonase til det rå lysat, inverteres til blanding og inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
- Rålysatet centrifugeres i 10 minutter ved 650 x g ved 18 °C.
- Supernatanten overføres til et rent 50 ml konisk rør. Dette er den rå virus. Kassér pelleten.
- Råvirus centrifugeres i yderligere 30 minutter ved 3000 x g ved 18 °C for at fjerne kontaminerende proteiner.
- Supernatanten overføres til et rent 50 ml konisk rør. Dette er den afklarede virus.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause på dette tidspunkt. Den klarede virus fryses ned til -70 °C. - Opsæt multikanals peristaltisk pumpe med fire peristaltiske rør (se materialetabel). Fastgør kapillærer til begge ender af hvert rør.
- Kapillærerne anbringes på pumpens indgangsside i et bægerglas fyldt med deioniseret vand. Kapillærerne anbringes på pumpens udgangsside i et tomt bægerglas. Kør den peristaltiske pumpe ved 25,0 o / min for at skylle slangen med deioniseret (DI) vand.
- Når den skylles grundigt, tømmes den peristaltiske slange ved at køre pumpen, indtil slangen kun er fyldt med luft. Læg alle kapillærer på en ren fnugfri aftørring.
- Anbring fire ultracentrifugerør i et stativ på pumpens udgangsside.
- Brug en 10 ml serologisk pipet til forsigtigt at dispensere 10 ml klaret virus i hvert ultracentrifugerør. Pas på ikke at indføre luftbobler.
BEMÆRK: Mængden af klaret virus i hvert rør kan strækkes til op til 12 ml pr. rør, hvis det er nødvendigt. Reducer mængden af 60% iodixanol passende i trin 2.25 nedenfor. - Den klarede virus er underlejret med iodixanolfraktioner (tabel 1) fra laveste densitet til højeste densitet ved hjælp af den peristaltiske pumpe. 15% fraktionen tilføjes først, efterfulgt af 25% fraktionen, 40% fraktionen og endelig 60% fraktionen. Overfør 22 ml (5,5 ml pr. ultracentrifugeglas) af 15% iodixanolfraktionen til et rent 50 ml konisk rør. Placer kapillærerne på pumpens indgangsside i røret, og pas på, at alle kapillærer berører bunden af røret.
- Start pumpen, og lad slangen fyldes med iodixanolfraktionen. Når iodixanolfraktionen når enderne af kapillærerne på pumpens udgangsside, skal du stoppe pumpen.
- Indsæt en udgangskapillær i hvert ultracentrifugerør med klaret virus, og pas på, at kapillærerne rører bunden af hvert ultracentrifugerør.
BEMÆRK: Det er af afgørende betydning, at der ikke er luft tilbage i kapillærerne. Iodixanol kan strømme gennem den peristaltiske slange med lidt forskellige hastigheder, så sørg for, at hver enkelt udgangskapillær er fuldstændigt fyldt med iodixanol, før du indsætter den i den klarede virus. Det kan være nødvendigt at stoppe og starte pumpen flere gange. - Start pumpen, og lad ultracentrifugeglassene fylde. Når den sidste af 15% fraktionen er ved at blive taget ind i indgangskapillærerne, skal du stoppe pumpen. Det er afgørende, at der ikke kommer luftbobler ind i den peristaltiske slange.
BEMÆRK: Hvis luftbobler trænger ind i indgangskapillærerne, kan pumpen kortvarigt køres i modsat retning for at skubbe dem ud igen. - Overfør 22 ml (5,5 ml pr. ultracentrifugeglas) af 25% iodixanolfraktionen til det 50 ml koniske rør. Pas på, at alle kapillærer rører bunden af røret og start pumpen. Når den sidste af 25% fraktionen er ved at blive taget ind i indgangskapillærerne, skal du stoppe pumpen.
- Gentag trin 2.24 med 20 ml (5 ml pr. ultracentrifugeglas) af 40% iodixanolfraktionen og derefter med 24 ml (6 ml pr. ultracentrifugeglas) af 60% fraktionen.
- Hvis der stadig er ufyldt volumen tilbage i ultracentrifugerøret, skal du fortsætte med at tilføje mere af 60% fraktionen, indtil ultracentrifugerørene er helt fyldt med væske.
- Fyld hvert rør, indtil lysatet laver en kuppel over toppen, men ikke løber over fra røret. Stop pumpen, og fjern forsigtigt hver udgangskapillær, og pas på ikke at forstyrre iodixanolgradienten.
- Hvert ultracentrifugerør dækkes med et afstandsstykke og fyldes i en type 70 Ti-rotor (se materialetabellen).
BEMÆRK: Sørg for, at rotoren er korrekt afbalanceret. Forsøg ikke at betjene ultracentrifugen uden ordentlig træning. - Type 70 Ti-rotoren hældes i ultracentrifugen, og der centrifugeres ved 489.000 x g i 1 time ved 18 °C.
- Efter centrifugering aflæses rotoren fra ultracentrifugen. Brug nåletang til forsigtigt at fjerne hvert ultracentrifugerør fra rotoren, og pas på ikke at forstyrre iodixanolgradienten.
- Brug et støtteringstativ med klemme til at fastgøre et ultracentrifugerør.
- Sæt en 20 GA kanyle på en 5 ml sprøjte og sæt den til side. Brug en fnugfri aftørring til at fjerne hætten fra ultracentrifugerøret.
- Penetrer væggen i ultracentrifugerøret med nålen ca. 3 mm under 40% -60% iodixanolgrænsefladen (figur 2).
- Suspirer langsomt grænsefladen og en del af 40% fraktionen. Undgå at opsuge toppen af 40% fraktionen, for et samlet træk på ca. 4 ml.
- Hold en finger over den åbne top af ultracentrifugerøret, træk sprøjten ud og overfør den opsugede AAV-fraktion til et 50 ml konisk rør. Kassér sprøjten i en kanylebeholder. Kassér ultracentrifugerøret.
- Gentag trin 2.31-2.35 for hvert ultracentrifugeglas.
- Den aspirerede AAV-fraktion fortyndes ca. to gange i AAV-lysisbuffer til et volumen på 40 ml.
- Skyl den peristaltiske slange som beskrevet i trin 2.16-2.17.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause på dette tidspunkt. Den fortyndede AAV-fraktion opbevares ved 0 °C natten over. - Hver af den fortyndede AAV-fraktion fyldes 20 ml i to nye ultracentrifugeglas.
- Til den anden runde af iodixanoldensitetsgradientcentrifugering underlægges den fortyndede AAV-fraktion som beskrevet ovenfor under anvendelse af kun 10 ml (5 ml pr. ultracentrifugeglas) af 40 %-fraktionen og 14 ml (7 ml pr. ultracentrifugeglas) af 60 %-fraktionen. Gentag trin 2.29-2.36 for ultracentrifugering og aspiration.
BEMÆRK: Før opbevaring af peristaltisk pumpe og slange skylles slangen ud med DI-vand som beskrevet i trin 2.16-2.17.
Figur 2: Iodixanol gradient med 40% -60% iodixanol interface mærket. (A) Første iodixanolgradient. Phenolrød anvendes i 40% iodixanol og 60% iodixanol fraktioner. Det fremstår som en anden farve på grund af forskellen i pH mellem de to fraktioner. Pilen angiver, hvor sprøjten skal indsættes for at høste rAAV-fraktionen, lige under 40%-60% iodixanol-grænsefladen. (B) Anden iodixanolgradient. Kun 40% og 60% iodixanol fraktioner anvendes i dette trin. Pilen angiver, hvor sprøjten skal indsættes for at høste rAAV-fraktionen. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Bufferudveksling og viruskoncentration
- Efter opnåelse af AAV-fraktionen fra den anden runde af iodixanoldensitetsgradientcentrifugering fortyndes den to gange med AAV-bufferopløsning.
- Centrifugalfilteret afbalanceres ved at tilsætte 20 ml AAV-bufferopløsning til toppen af filteret. Apparatet centrifugeres ved 3000 x g ved 18 °C i 5 minutter, og gennemstrømningen kasseres.
- Den fortyndede AAV-fraktion tilsættes centrifugalfilteret. Apparatet centrifugeres ved 3000 x g ved 18 °C i 5 minutter, og gennemstrømningen kasseres.
- Tilsæt 20 ml AAV-bufferopløsning til toppen af filteret. Apparatet centrifugeres ved 3000 x g ved 18 °C i 5 minutter, og gennemstrømningen kasseres.
BEMÆRK: Hvis centrifugalfiltermembranen blokeres, hvilket får opløsningen til at strømme ineffektivt igennem, skal du forsigtigt bruge en P200-mikropipette til at trække opløsningen op og ned i toppen af filteret. Vær yderst forsigtig med ikke at røre filteret med mikropipettespidsen. - Gentag trin 3.4 to gange mere.
BEMÆRK: Sørg for, at AAV'en ikke er overkoncentreret ved at opretholde mindst 1 ml volumen i toppen af filteret. Det kan være nødvendigt at justere centrifugeringstiderne for at forhindre overkoncentration. Hvis AAV er overkoncentreret, kan nedbør forekomme. - For en sidste titer i området 1012 vg / ml drejes virussen ned til et slutvolumen på ca. 1 ml.
BEMÆRK: Afhængigt af den anvendte serotype-rygrad og virusets emballeringseffektivitet skal du muligvis koncentrere virussen i et mindre volumen. - Brug en p1000 mikropipette til at overføre den koncentrerede AAV fra toppen af centrifugalfilteret til et mikrocentrifugerør. Brug en p200-mikropipette til at vaske centrifugalfilteret med 50 μL AAV-buffer for at opsamle eventuel resterende virus og samle med resten af den koncentrerede AAV.
- Der afsættes en 2 μL delprøve af den koncentrerede AAV til titering. Se supplerende tabel 1 for at se ITR-primere, der kan bruges til qPCR.
- Før den koncentrerede AAV gennem et 0,2 μm sprøjtefilter for at sterilisere den.
BEMÆRK: Når du steriliserer et lille volumen, skal du sørge for at vælge et sprøjtefilter med en lille diameter for at minimere virustab. Brug af et lavproteinbindingsfilter med en lille diameter vil resultere i minimalt virustab (data ikke vist). - Den steriliserede AAV kan anvendes straks til transducecelle eller opbevares ved 4 °C til brug inden for fire uger. Det bør opbevares ved -70 °C til længerevarende opbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metode kan anvendes til at opnå titere på mindst 1012 virale partikler pr. ml. En titer kan opnås (figur 3) ved qPCR ved hjælp af ITR-primerne i supplerende tabel 1, ved ddPCR eller ved enhver anden titeringsmetode. Suboptimale titere kan skyldes brug af et cap-gen , der koder for et capsid med dårlig emballageeffektivitet.
En anden mulig kilde til suboptimale resultater er den dårlige transduktionseffektivitet af Expi293-celler. Det anbefales at have celler med en densitet på 3-4 x 106 vc/ml på transfektionsdagen, og at cellens levedygtighed er tæt på 98%. I denne undersøgelse opnåede forfatterne en titer på 1,07 x 1012 vg efter denne protokol. Dette udbytte stemmer overens med tidligere udbytter opnået fra emballage AAVrh7418.
Figur 3: Titerbestemmelse ved qPCR. Kurve 1 blev genereret med en standardkoncentration på 3,66 x 1011 vg/ml, kurve 2 blev genereret med en standardkoncentration på 3,66 x 1010 vg/ml, kurve 3 var den endelige koncentrerede AAV-prøve, kurve 4 blev genereret med en standardkoncentration på 3,66 x 109 vg/ml, og kurve 5 blev genereret med en standardkoncentration på 3,66 x 108 vg/ml. Hver qPCR-reaktion blev udført i to eksemplarer. (A) qPCR-forstærkningskurve. Standarder blev genereret ved seriel fortynding af en AAV-standard, der blev titteret af ddPCR. Koncentrationen af den ufortyndede standard var 3,66 x 1012 vg/ml. (B) Standardkurve genereret af qPCR. Den producerede AAV blev bestemt til at have en koncentration på 1,85 x 1011 vg / ml i 5,75 ml for et samlet udbytte på 1,07 x 1012 vg. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Fremadgående og omvendte primersekvenser for inverterede AAV-terminalgentagelser (ITR'er). Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den dobbelte iodixanol densitetsgradient oprensningsprotokol er den universelle metode, fordi den gælder for alle AAV-mutantvarianter, uanset deres receptorspecificitet. Tidlige metoder til AAV-oprensning var afhængige af partikeldensitet og omfattede isopycnic centrifugering i CsCl og kontinuerlig saccharosedensitetsgradientcentrifugering19. Senere blev serotypespecifikke tilgange udviklet, som gjorde brug af monoklonale antistoffer bundet til Sepharose kolonne20. En ny densitetsbaseret rensningsmetode ved hjælp af en diskontinuerlig iodixanolgradient blev udviklet i 1999 og gav AAV-isolater med højere infektivitet end dem, der blev isoleret fra CsCl-gradienter21. Metoder til rensning af AAV fortsatte med at blive udviklet i begyndelsen af 2000'erne, da nogle grupper brugte højtydende væskekromatografi til at rense rAAV med genopretning fra rålysat på over 70% 22,23,24. Disse metoder anvendes stadig i store fremstillingsprocesser25. På trods af udviklingen af kromatografimetoder til isolering af AAV anvendes oprensning ved iodixanoldensitetsgradientcentrifugering stadig i vid udstrækning på grund af dets lavere omkostninger og serotypeagnosticisme26,27.
Selvom denne metode er velegnet til tidseffektiv præklinisk produktion af rAAV, er den meget begrænset i sin skalerbarhed og evne til at blive tilpasset til cGMP-fremstilling25. Som beskrevet ovenfor foretrækkes således andre rensningsmetoder til storskala produktion. Derudover er transgenkapaciteten af rAAV-vektorer begrænset. Størrelsesgrænsen for et AAV-genom, der kan pakkes intakt, har vist sig at være ca. 5,2 kb, for en maksimal transgenstørrelse på 4,9 kb, der tegner sig for ITR6. Dette komplicerer ekspressionen af proteiner, hvis cDNA overstiger denne kapacitet. Disse proteiner kan ikke udtrykkes af det her beskrevne system uden ændring af selve transgenet eller anvendelse af et delt vektorsystem. Chamberlain et al. beskriver flere metoder til at udtrykke transgener større end 4,9 kb28.
Denne metode er især nyttig til produktion af kombinatoriske capsidbiblioteker med høj kompleksitet indeholdende AAV-kapsider med forskellige biokemiske egenskaber på grund af mutationer, der er til stede på kapsidoverfladen. Hvis rAAV-præparatet er bestemt til injektion hos dyr, især hos primater, er det afgørende at begrænse endotoksinkontaminering. Der skal udvises stor omhu for at adskille områder, der bruges til at dyrke bakteriekulturer, fra rAAV-produktion for at forhindre bakteriel kontaminering under alle trin. Udfør alt arbejde med humane celler og rå AAV i et biosikkerhedsskab ved hjælp af engangsplastvarer. Dette forhindrer bakteriel kontaminering og er en nødvendighed for at arbejde med AAV, da det er et BSL1-middel.
Hvis et laboratorium ikke har adgang til en CO2 -inkubator med en ryster, kan vedhængende cellekultur med HEK293 -celler anvendes i stedet for Expi293 suspension cellekultur. Følg producentens instruktioner til subkultur, og brug transfektionsprotokollen beskrevet i Crosson et al., 201817.
Kritiske trin i denne protokol er Expi293-transfektion, forberedelse af iodixanolgradienten og aspiration af iodixanolfraktionen indeholdende AAV. Fejl under et af disse trin kan resultere i suboptimale rAAV-udbytter eller manglende produktion af rAAV.
Transfektion af Expi293-cellerne er et kritisk trin i produktionen af rAAV ved hjælp af denne protokol. På transfektionsdagen resuspenderes cellerne i et halvt volumen friske medier for at give dem de næringsstoffer, der er nødvendige for at komme sig efter transfektion29; Transfektion er en meget belastende proces for cellerne. Imidlertid kasseres det konditionerede medie ikke helt, fordi det indeholder vækstfaktorer og andre metabolitter, der er vigtige for cellevedligeholdelse og vækst. Det er kritisk, at PEI og DNA inkuberes i hele ti minutter, før de påføres celler for at danne et ladet kompleks30. Uden at danne et kompleks med PEI vil DNA ikke blive effektivt optaget af celler.
Ved fremstilling af rAAV afhænger andelen af virus, der findes i medierne, af den pågældende serotypes interaktioner med Expi293-cellereceptorer. Nogle serotyper frigives i cellemedier med højere hastigheder end andre31, hvilket nødvendiggør, at virale partikler udfældes fra cellemedier for at fange det højest mulige udbytte og forhindre tab af varianter baseret på manglende affinitet for Expi293-cellereceptorer. I modsætning hertil har serotypen AAV2 stærke receptorinteraktioner med heparansulfatproteoglycaner til stede i 293 celler, så meget lidt pakket virus findes i medierne32. Når du producerer et derivat af AAV2, skal du udelade PEG-udfældningstrinnet. Til fremstilling af kombinatoriske capsidbiblioteker eller rAAV af alternative serotyper er udfældning af virale partikler med PEG passende.
Det er afgørende, at 1 M natriumchlorid er til stede i 15% iodixanolfraktionen for at adskille aggregerede AAV-partikler under ultracentrifugering. Udeladelsen af NaCl i denne fraktion kan føre til uønskede resultater, såsom fald i transduktionseffektivitet og immunogenicitet33. Endelig skal du være meget forsigtig med at aspirere AAV fra iodixanolgradienten. Opsugning af for meget af iodixanolfraktionen kan resultere i tilstedeværelsen af tomme kapsider i slutproduktet17.
Denne metode kan bruges til at pakke rAAV kombinatoriske capsidbiblioteker til brug i downstream-rettede evolutionseksperimenter for at identificere kapsider med højere tropisme for visse humane celletyper. rAAV er stabil ved 4 °C ved kortvarig brug og ved -70 °C ved langtidsopbevaring34. I øjeblikket er den rekombinante AAV i brug i fem FDA-godkendte lægemidler, der behandler tilstande, herunder Duchenne muskeldystrofi 35,36,37. Der er flere yderligere rAAV-behandlinger i kliniske og prækliniske forsøg 38,39,40. Yderligere forskning i denne vektor er derfor afgørende for udviklingen af yderligere genterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger at rapportere.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
- Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
- Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration. BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).
- George, L. A., et al. Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A. N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy. Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. cD.
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).
- Zolotukhin, S. Production of recombinant adeno-associated virus vectors. Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).
- Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N., Ayuso, E. Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production. Mol Ther - Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).
- Costa-Verdera, H., et al. Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).
- Ertl, H. C. J. Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression. Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).
- Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
- Marsic, D., et al. Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants. Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).
- Grimm, D., Zolotukhin, S. E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution. Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).
- Biswas, M., et al. Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity. Mol Ther - Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).
- Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).
- Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation. Mol Ther - Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).
- Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting. Viruses. 15 (11), 2168 (2023).
- Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis. Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
- Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Debelak, D., et al. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2. J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).
- Burova, E., Ioffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
- Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).
- Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids. Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).
- Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein. BMC Biotechnol. 23 (1), 7 (2023).
- Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability. Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
- Wright, J. F., et al. Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation. Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).
- Gruntman, A. M., et al. Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).
- Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
- Mullard, A. FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections. Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).
- Center for Biologics Evaluation and Research. Approved Cellular and Gene Therapy Products. US Food Drug Adm. , (2023).
- Kang, L., et al. AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges. J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).
- De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Hemophilia gene therapy: The end of the beginning. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).
- Simons, E. J., Trapani, I. The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).
