Summary
El virus adenoasociado se produce en cultivo celular en suspensión y se purifica mediante centrifugación de doble gradiente de densidad de yodixanol. Se incluyen medidas para aumentar el rendimiento total del virus, disminuir el riesgo de precipitación del virus y concentrar aún más el producto final del virus. Los títulos finales esperados alcanzan las 1012 partículas virales/ml y son adecuados para el uso preclínico in vivo .
Abstract
Este protocolo describe la producción y purificación de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) mediante centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol, un método independiente del serotipo para purificar AAV descrito por primera vez en 1999. Los vectores rAAV se utilizan ampliamente en aplicaciones de terapia génica para administrar transgenes a varios tipos de células humanas. En este trabajo, el virus recombinante se produce por transfección de células Expi293 en cultivo en suspensión con plásmidos que codifican los genes transgénicos, de la cápside del vector y de los genes auxiliares adenovirales. La centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol purifica las partículas AAV completas en función de la densidad de partículas. Además, se incluyen tres pasos en esta metodología ahora omnipresente para aumentar el rendimiento total del virus, disminuir el riesgo de precipitación debido a proteínas contaminantes y concentrar aún más el producto final del virus, respectivamente: precipitación de partículas virales de medios celulares utilizando una solución de polietilenglicol (PEG) y cloruro de sodio, la introducción de una segunda ronda de centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol, y el intercambio de tampón a través de un filtro centrífugo. Con este método, es posible lograr títulos consistentes en el rango de 10a 12 partículas virales/ml de pureza excepcional para uso in vivo .
Introduction
Los vectores virales adenoasociados recombinantes (rAAV) son herramientas ampliamente utilizadas para el tratamiento de enfermedades genéticas, como la atrofia muscular espinal, la distrofia retiniana y la hemofilia A 1,2,3. Los vectores rAAV están diseñados para carecer de genes virales presentes en el AAV4 de tipo salvaje, un virus icosaédrico pequeño y sin envoltura con un genoma lineal de ADN monocatenario de 4,7 kb. El AAV se descubrió por primera vez en la década de 1960 como un contaminante de las preparaciones de adenovirus5. A pesar de su pequeño tamaño de cápside, que limita el tamaño del transgén que se puede empaquetar a un máximo de 4,9 kb excluyendo los RTI6, el AAV es útil para la administración de transgenes porque no es patógeno en humanos, permite la expresión del transgén en muchos tipos de células que se dividen y no se dividen, y tiene efectos inmunogénicos limitados7.
Como miembros del género dependoparvovirus, la producción de rAAVs se basa en la expresión de genes auxiliares presentes en el adenovirus o virus del herpes simple8. Se han desarrollado varias estrategias para producir rAAV, pero la producción en células HEK293 transformadas con los genes auxiliares adenovirales E1A/E1B es el método más establecido y utilizado en la actualidad9. El enfoque general de la producción de rAAV comienza con la transfección de células HEK293 con tres plásmidos que contienen el transgén dentro de repeticiones terminales invertidas (ITR), genes AAV rep y cap , y genes auxiliares adenovirales adicionales, respectivamente. Setenta y dos horas después de la transfección, las células se cosechan y procesan para purificar el rAAV que contiene el transgén.
En el desarrollo de nuevos vectores rAAV con fines terapéuticos, uno de los principales objetivos es producir vectores con una mayor eficiencia de transducción. Un aumento en la eficiencia de transducción de las células diana significaría una disminución de la dosis clínica necesaria de rAAV, disminuyendo así la probabilidad de efectos inmunogénicos adversos que van desde la neutralización mediada por anticuerpos hasta toxicidades agudas10,11. Para mejorar la eficacia de la transducción de los vectores rAAV, se pueden realizar alteraciones en el genoma empaquetado o en la cápside. Los métodos viables para ajustar la eficacia de la transducción a través del diseño del genoma empaquetado incluyen la incorporación de promotores fuertes y específicos de tejido, la selección cuidadosa de los elementos de procesamiento del ARNm y la optimización de la secuencia de codificación para mejorar la eficiencia de la traducción12. Las alteraciones de la cápside se realizan con el objetivo de aumentar el tropismo para los tipos de células humanas diana. Los esfuerzos para desarrollar nuevas cápsidas de vectores de administración de transgenes rAAV generalmente se caracterizan por un enfoque en el diseño racional de cápsidas de AAV con mutaciones específicas dirigidas a receptores celulares específicos o la evolución dirigida para identificar cápsidas con tropismo para tipos celulares específicos a partir de bibliotecas de cápside combinatorias de alta complejidad sin dirigirse a un receptor específico (aunque algunos grupos combinan estos enfoques)13, 14,15. En el enfoque de evolución dirigida, las bibliotecas combinatorias de la cápside se construyen utilizando una columna vertebral de serotipo particular con regiones variables mutadas en el exterior de la cápside16. Las bibliotecas combinatorias de cápside a menudo se construyen a partir de serotipos de AAV que no se originan en humanos, lo que disminuye el riesgo de inmunidad preexistente durante el uso clínico10. Por lo tanto, los métodos de purificación que se pueden aplicar a cualquier serotipo son ideales para eliminar la necesidad de una optimización específica del serotipo para los serotipos menos utilizados que sirven como columna vertebral para estas bibliotecas.
La centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol se utiliza para purificar altos títulos de rAAV con alta infectividad17. En este protocolo, el rAAV se produce en cultivo celular en suspensión para disminuir la cantidad de mano de obra necesaria para producir grandes títulos de AAV. También se incluye un paso de centrifugación para limpiar el lisado celular para reducir la presencia de proteínas contaminantes y disminuir el riesgo de precipitación de virus. Este protocolo es un método rentable para producir preparaciones de rAAV de alta pureza adecuadas para uso preclínico.
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Protocol
La composición de las soluciones y tampones utilizados en este protocolo se proporciona en la Tabla 1.
| Solución | Composición | |
| Tampón de lisis AAV | 1,2 ml de solución de NaCl 5 M | |
| 2 ml de solución de Tris-HCl 1 M pH 8,5 | ||
| 80 uL de solución de 1 M de MgCl2 | ||
| mQ de agua a 40 mL | ||
| Solución de precipitación AAV | 40 g PEG 8000 | |
| 50 ml de solución de NaCl 5 M | ||
| mQ de agua hasta 100 mL | ||
| Fracción de yodixanol al 15% | OptiPrep de 7,5 ml | |
| 3 ml de DPBS 10X | ||
| 6 ml de solución de NaCl 5 M | ||
| 30 uL de solución de 1 M de MgCl2 | ||
| mQ a 30 mL | ||
| Fracción de yodixanol al 25% | 12. 5 ml de OptiPrep | |
| 3 ml de DPBS 10X | ||
| 30 uL de solución de 1 M de MgCl2 | ||
| 60 uL de solución de rojo de fenol | ||
| mQ a 30 mL | ||
| Fracción de yodixanol al 40% | 33.3 mL OptiPrep | |
| 5 ml de DPBS 10X | ||
| 50 uL de solución de 1 M de MgCl2 | ||
| mQ a 50 mL | ||
| Fracción de yodixanol al 60% | 50 ml de OptiPrep | |
| 100 uL de solución de rojo de fenol | ||
| Solución tampón AAV | 8 mL de NaCl 5 M | |
| 20 uL de F-68 plurónico al 10% | ||
| PBS hasta 200 mL | ||
Tabla 1: Composiciones de soluciones para las soluciones utilizadas en este protocolo.
1. Triple transfección de células Expi293
- Siembra de células Expi293 (ver Tabla de Materiales) a una densidad inicial de 5 x 105 células viables (vc)/mL.
- Dejar incubar las células a 37 °C con 8% de CO2 y una velocidad de agitación de 125 rpm hasta que alcancen una densidad de 3-5 x 106 vc/mL. Monitoree la densidad celular y la viabilidad utilizando la exclusión de azul de tripano con un contador de células automatizado (consulte la tabla de materiales).
- Cuando las células alcancen la densidad celular deseada, divídalas de 1 a 10 añadiendo medios nuevos para que su volumen total sea diez veces mayor que su volumen original. Si es necesario, transfiera las células a un matraz más grande. Regrese a la incubación.
- Continúe expandiendo las células como se describe en los pasos 1.2-1.3 hasta que alcancen una densidad de al menos 2 x 106 vc/mL en 250 mL de medio en un matraz de 1 L.
- El día antes de la transfección, diluir las células a 2 x 106 vc/mL en 250 mL de medio, desechando el exceso de células según sea necesario. Incuba las células durante la noche.
- El día de la transfección, centrifugar la mitad de las células a 58 x g durante 5 min a 18 °C. Vuelva a suspender el gránulo celular en el mismo volumen (125 ml) de medio fresco. La viabilidad celular debe ser cercana al 98%.
- Prepare dos tubos cónicos de 50 ml. Etiqueta uno como "PEI" y el otro como "ADN".
- En el tubo cónico marcado como PEI, diluya 1,2 mL de PEI (Polietilenimina, ver Tabla de Materiales) hasta un volumen total de 12,5 mL en medios OptiMEM.
- En el tubo cónico marcado con ADN, prepare una solución equimolar de ADN plasmídico hasta un total de 500 μg de ADN en un volumen total de 12,5 ml en medios OptiMEM.
- Agregue la solución de ADN a la solución de PEI, invierta varias veces para combinar bien y deje incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
NOTA: Es fundamental que se permita que la solución de ADN-PEI se incube durante los 10 minutos completos para que el PEI forme complejos cargados con el ADN. - Después de que la solución de ADN-PEI se haya incubado durante 10 minutos, use una pipeta serológica para aplicar lentamente la solución de ADN-PEImax a las células Expi293. Regrese las células transfectadas a la incubadora y déjelas incubar durante 72 h (Figura 1).
Figura 1: Células Expi293 que expresan GFP dos días después de la transfección. Después de la transfección con un plásmido que contiene un gen para GFP, las células Expi293 expresan eGFP transitoriamente. La morfología celular es redonda. La imagen fue capturada con un tiempo de exposición de 15 ms. Las imágenes microscópicas se adquieren utilizando un microscopio invertido equipado con iluminación de epifluorescencia y un objetivo de 10x/0,30. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Purificación del vector rAAV
- Después de 72 h, transfiera las células en suspensión a dos tubos cónicos de 250 ml y gírelos a 415 x g durante 10 min a 4 °C.
- Vierta el medio sobrenadante en un tubo cónico fresco de 500 ml y guárdelo a 0 °C en hielo para su posterior procesamiento.
- Vuelva a suspender cada gránulo celular en 10 ml de tampón de lisis AAV (Tabla 1). Agrupa los dos lisados juntos en uno de los tubos. Enjuague el otro tubo con 5 ml adicionales de tampón de lisis AAV, luego agréguelo a los lisados agrupados. Congelar a -70 °C.
NOTA: El experimento se puede pausar en este punto. Almacene el medio sobrenadante a -70 °C en lugar de sobre hielo. - Agregue un volumen 1:4 de solución de precipitación AAV al medio sobrenadante del paso 2.2. Invierta varias veces para mezclar bien e incubar a 0 °C en hielo durante al menos 2 h o toda la noche.
- Centrifugar la solución incubada a 3000 x g durante 1 h a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo que contiene el precipitado viral en 5 ml de tampón de lisis AAV.
- Descongelar el lisado celular a 37 °C en un baño de agua.
- Agrupar el precipitado viral con el lisado celular. Este es el lisado crudo. Enjuague el tubo de centrifugación que contenía el precipitado viral con 5 ml adicionales de tampón de lisis AAV y mezcle con el lisado crudo.
- Congelar el lisado crudo a -70 °C y luego descongelar a 37 °C. Repite este ciclo una vez más.
NOTA: El lisado crudo no debe dejarse a 37 °C durante más tiempo del necesario para descongelarlo. - Una vez descongelado por tercera vez, añadir inmediatamente 4 μL de benzonasa al lisado crudo, invertir para mezclar e incubar durante 30 min a 37 °C.
- Centrifugar el lisado crudo durante 10 min a 650 x g a 18 °C.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo cónico limpio de 50 ml. Este es el virus crudo. Deseche el gránulo.
- Centrifugar el virus crudo durante 30 minutos adicionales a 3000 x g a 18 °C para eliminar las proteínas contaminantes.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo cónico limpio de 50 ml. Este es el virus aclarado.
NOTA: El experimento se puede pausar en este punto. Congele el virus clarificado a -70 °C. - Configure la bomba peristáltica multicanal con cuatro tubos peristálticos (consulte la tabla de materiales). Conecte los capilares a ambos extremos de cada tubo.
- Coloque los capilares en el lado de entrada de la bomba en un vaso de precipitados lleno de agua desionizada. Coloque los capilares en el lado de salida de la bomba en un vaso de precipitados vacío. Haga funcionar la bomba peristáltica a 25.0 rpm para enjuagar la tubería con agua desionizada (DI).
- Cuando esté completamente enjuagado, vacíe el tubo peristáltico haciendo funcionar la bomba hasta que el tubo se llene solo con aire. Coloque todos los capilares sobre una toallita limpia y sin pelusa.
- Coloque cuatro tubos de ultracentrífuga en una rejilla en el lado de salida de la bomba.
- Utilice una pipeta serológica de 10 ml para dispensar cuidadosamente 10 ml de virus clarificado en cada tubo de ultracentrífuga. Tenga cuidado de no introducir burbujas de aire.
NOTA: El volumen de virus clarificado en cada tubo se puede estirar hasta 12 ml por tubo, si es necesario. Reduzca la cantidad de yodixanol al 60% de manera adecuada en el paso 2.25 a continuación. - El virus clarificado se recubre con fracciones de yodixanol (Tabla 1) de menor a mayor densidad utilizando la bomba peristáltica. Primero se agrega la fracción del 15%, seguida de la fracción del 25%, la fracción del 40% y finalmente la fracción del 60%. Transfiera 22 ml (5,5 ml por tubo de ultracentrífuga) de la fracción de yodixanol al 15 % a un tubo cónico limpio de 50 ml. Coloque los capilares en el lado de entrada de la bomba en el tubo, teniendo cuidado de que todos los capilares toquen la parte inferior del tubo.
- Encienda la bomba y deje que el tubo se llene con la fracción de yodixanol. Cuando la fracción de yodixanol llegue a los extremos de los capilares en el lado de salida de la bomba, detenga la bomba.
- Inserte un capilar de salida en cada tubo de ultracentrífuga con virus clarificado, teniendo cuidado de que los capilares toquen el fondo de cada tubo de ultracentrífuga.
NOTA: Es de vital importancia que no quede aire en los capilares. El yodixanol puede fluir a través del tubo peristáltico a velocidades ligeramente diferentes, así que asegúrese de que cada capilar de salida individual esté completamente lleno de yodixanol antes de insertarlo en el virus clarificado. Puede ser necesario detener y arrancar la bomba varias veces. - Encienda la bomba y deje que los tubos de ultracentrífuga se llenen. Cuando la última fracción del 15% esté a punto de ser introducida en los capilares de entrada, detenga la bomba. Es fundamental que no entren burbujas de aire en el tubo peristáltico.
NOTA: Si las burbujas de aire entran en los capilares de entrada, la bomba puede funcionar brevemente en la dirección inversa para empujarlas hacia afuera. - Transfiera 22 ml (5,5 ml por tubo de ultracentrífuga) de la fracción de yodixanol al 25 % en el tubo cónico de 50 ml. Tenga cuidado de que todos los capilares toquen el fondo del tubo y encienda la bomba. Cuando la última fracción del 25% esté a punto de ser introducida en los capilares de entrada, detenga la bomba.
- Repita el paso 2.24 con 20 ml (5 ml por tubo de ultracentrífuga) de la fracción de yodixanol al 40 % y luego con 24 ml (6 ml por tubo de ultracentrífuga) de la fracción al 60 %.
- Si todavía queda volumen sin llenar en el tubo de ultracentrífuga, continúe agregando más de la fracción del 60% hasta que los tubos de ultracentrífuga estén completamente llenos de líquido.
- Llene cada tubo hasta que el lisado forme una cúpula sobre la parte superior, pero no se desborde del tubo. Detenga la bomba y retire con cuidado cada capilar de salida, teniendo cuidado de no alterar el gradiente de yodixanol.
- Tape cada tubo de ultracentrífuga con un espaciador y cárguelo en un rotor Tipo 70 Ti (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: Asegúrese de que el rotor esté correctamente equilibrado. No intente operar la ultracentrífuga sin la capacitación adecuada. - Cargue el rotor Tipo 70 Ti en la ultracentrífuga y centrifugue a 489.000 x g durante 1 h a 18 °C.
- Después de la centrifugación, descargue el rotor de la ultracentrífuga. Utilice unos alicates de punta fina para retirar con cuidado cada tubo de ultracentrífuga del rotor, teniendo cuidado de no alterar el gradiente de yodixanol.
- Utilice un soporte de anillo de soporte con abrazadera para asegurar un tubo de ultracentrífuga.
- Coloque una aguja de 20 GA en una jeringa de 5 ml y déjela a un lado. Use una toallita sin pelusa para quitar la tapa del tubo de ultracentrífuga.
- Penetrar en la pared del tubo de ultracentrífuga con la aguja unos 3 mm por debajo de la interfase de yodixanol al 40%-60% (Figura 2).
- Aspirar lentamente la interfaz y parte de la fracción del 40%. Evite aspirar la parte superior de la fracción del 40%, para un consumo total de aproximadamente 4 ml.
- Sosteniendo un dedo sobre la parte superior abierta del tubo de ultracentrífuga, saque la jeringa y transfiera la fracción AAV aspirada a un tubo cónico de 50 ml. Deseche la jeringa en un recipiente para objetos punzocortantes. Deseche el tubo de ultracentrífuga.
- Repita los pasos 2.31-2.35 para cada tubo de ultracentrífuga.
- Diluir la fracción de AAV aspirada aproximadamente dos veces en tampón de lisis de AAV a un volumen de 40 ml.
- Enjuague el tubo peristáltico como se describe en los pasos 2.16-2.17.
NOTA: El experimento se puede pausar en este punto. Almacenar la fracción diluida de AAV a 0 °C durante la noche. - Cargue 20 ml de cada fracción diluida de AAV en dos nuevos tubos de ultracentrífuga.
- Para la segunda ronda de centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol, la fracción diluida de AAV se superpone como se describió anteriormente utilizando solo 10 ml (5 ml por tubo de ultracentrífuga) de la fracción del 40% y 14 ml (7 ml por tubo de ultracentrífuga) de la fracción del 60%. Repita los pasos 2.29-2.36 para la ultracentrifugación y la aspiración.
NOTA: Antes de almacenar la bomba peristáltica y el tubo, enjuague el tubo con agua desionizada como se describe en los pasos 2.16-2.17.
Figura 2: Gradiente de yodixanol con una interfaz de iodixanol del 40%-60% marcada. (A) Primer gradiente de yodixanol. El rojo de fenol se utiliza en las fracciones de 40% de yodixanol y 60% de yodixanol. Aparece como un color diferente debido a la diferencia de pH entre las dos fracciones. La flecha indica dónde se debe insertar la jeringa para recolectar la fracción rAAV, justo debajo de la interfaz de 40%-60% de yodixanol. (B) Segundo gradiente de yodixanol. Solo se utilizan las fracciones de yodixanol al 40% y al 60% en este paso. La flecha indica dónde se debe insertar la jeringa para recolectar la fracción rAAV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
3. Intercambio de tampones y concentración del virus
- Después de obtener la fracción AAV de la segunda ronda de centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol, diluirla dos veces con una solución tampón AAV.
- Equilibre el filtro centrífugo agregando 20 ml de solución tampón AAV en la parte superior del filtro. Centrifugar el aparato a 3000 x g a 18 °C durante 5 min y desechar el flujo.
- Agregue la fracción AAV diluida al filtro centrífugo. Centrifugar el aparato a 3000 x g a 18 °C durante 5 min y desechar el flujo.
- Agregue 20 ml de solución tampón AAV en la parte superior del filtro. Centrifugar el aparato a 3000 x g a 18 °C durante 5 min y desechar el flujo.
NOTA: Si la membrana del filtro centrífugo se bloquea, lo que hace que la solución fluya de manera ineficiente, use con cuidado una micropipeta P200 para extraer la solución hacia arriba y hacia abajo en la parte superior del filtro. Tenga mucho cuidado de no tocar el filtro con la punta de la micropipeta. - Repita el paso 3.4 dos veces más.
NOTA: Asegúrese de que el AAV no esté demasiado concentrado manteniendo al menos 1 ml de volumen en la parte superior del filtro. Puede ser necesario ajustar los tiempos de centrifugación para evitar la sobreconcentración. Si el AAV está sobreconcentrado, puede producirse precipitación. - Para obtener un título final en el rango de 10a 12 vg/mL, reduzca el virus hasta un volumen final de aproximadamente 1 mL.
NOTA: Dependiendo de la columna vertebral del serotipo utilizada y de la eficiencia de empaquetamiento del virus, es posible que tenga que concentrar el virus en un volumen menor. - Utilice una micropipeta p1000 para transferir el AAV concentrado desde la parte superior del filtro centrífugo a un tubo de microcentrífuga. Utilice una micropipeta p200 para lavar el filtro centrífugo con 50 μL de tampón AAV para recoger cualquier virus restante y acumularlo con el resto del AAV concentrado.
- Reserve una alícuota de 2 μL del AAV concentrado para la valoración. Consulte la Tabla complementaria 1 para ver los cebadores ITR que se pueden utilizar para la qPCR.
- Pase el AAV concentrado a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm para esterilizarlo.
NOTA: Al esterilizar un volumen pequeño, tenga cuidado de seleccionar un filtro de jeringa con un diámetro pequeño para minimizar la pérdida de virus. El uso de un filtro de unión a proteínas de bajo contenido de un diámetro pequeño dará como resultado una pérdida viral mínima (datos no mostrados). - El AAV esterilizado puede utilizarse inmediatamente para transducir células o almacenarse a 4 °C para su uso en un plazo de cuatro semanas. Debe almacenarse a -70 °C para un almacenamiento más prolongado.
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Representative Results
Este método se puede utilizar para obtener títulos de al menos 10a 12 partículas virales por ml. Se puede obtener un título (Figura 3) por qPCR utilizando los cebadores ITR proporcionados en la Tabla Suplementaria 1, por ddPCR o por cualquier otro método de titulación. Los títulos subóptimos podrían ser el resultado del uso de un gen de la cápsula que codifica una cápside con una eficiencia de envasado deficiente.
Otra posible fuente de resultados subóptimos es la escasa eficiencia de transducción de las células Expi293. Se recomienda tener células a una densidad de 3-4 x 106 vc/mL el día de la transfección y que la viabilidad celular sea cercana al 98%. En el presente estudio, los autores obtuvieron un título de 1,07 x 1012 vg siguiendo este protocolo. Este rendimiento se alinea con los rendimientos anteriores obtenidos del envasado AAVrh7418.
Figura 3: Determinación del título mediante qPCR. La curva 1 se generó con una concentración estándar de 3.66 x 1011 vg/mL, la curva 2 se generó con una concentración estándar de 3.66 x10 10 vg/mL, la curva 3 fue la muestra final concentrada de AAV, la curva 4 se generó con una concentración estándar de 3.66 x 109 vg/mL y la curva 5 se generó con una concentración estándar de 3.66 x 108 vg/mL. Cada reacción de qPCR se realizó por duplicado. (A) Curva de amplificación de qPCR. Los patrones se generaron mediante la dilución seriada de un patrón AAV titulado por ddPCR. La concentración del patrón sin diluir fue de 3,66 x 1012 vg/mL. (B) Curva estándar generada por qPCR. Se determinó que el AAV producido tenía una concentración de 1.85 x10 11 vg/mL en 5.75 mL, para un rendimiento total de 1.07 x 1012 vg. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla suplementaria 1: Secuencias de cebadores directos e inversos para repeticiones terminales invertidas (RTI) AAV. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El protocolo de purificación de doble gradiente de densidad de yodixanol es el método universal porque es aplicable a cualquier variante mutante de AAV, independientemente de su especificidad de receptor. Los primeros métodos de purificación de AAV se basaban en la densidad de partículas e incluían la centrifugación isopícnica en CsCl y la centrifugación continua en gradiente de densidad de sacarosa19. Posteriormente, se desarrollaron abordajes seroespecíficos que hicieron uso de anticuerpos monoclonales unidos a columnas de Sepharose20. En 1999 se desarrolló un nuevo método de purificación basado en la densidad utilizando un gradiente discontinuo de yodixanol que produjo aislados de AAV con mayor infectividad que los aislados de gradientes de CsCl21. Los métodos para purificar el AAV continuaron desarrollándose hasta principios de la década de 2000, ya que algunos grupos utilizaron cromatografía líquida de alta resolución para purificar el rAAV con una recuperación del lisado crudo superior al 70%22,23,24. Estos métodos se siguen utilizando en los procesos de fabricación a gran escala25. A pesar del desarrollo de métodos de cromatografía para aislar AAV, la purificación por centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol sigue siendo ampliamente utilizada debido a su menor costo y al agnosticismo del serotipo26,27.
Si bien este método es muy adecuado para la producción preclínica eficiente en el tiempo de rAAV, es muy limitado en su escalabilidad y capacidad para adaptarse a la fabricación de cGMP25. Por lo tanto, como se describió anteriormente, se prefieren otros métodos de purificación para la producción a gran escala. Además, la capacidad transgénica de los vectores rAAV es limitada. Se ha encontrado que el límite de tamaño para un genoma AAV que se puede empaquetar intacto es de aproximadamente 5,2 kb, para un tamaño máximo de transgén de 4,9 kb, lo que representa el ITR6. Esto complica la expresión de proteínas cuyo ADNc supera esta capacidad. Estas proteínas no pueden ser expresadas por el sistema descrito aquí sin la modificación del propio transgén o el uso de un sistema de vector dividido. Chamberlain et al. describen varios métodos para expresar transgenes mayores de 4,9 kb28.
Este método es particularmente útil para la producción de bibliotecas combinatorias de cápside de alta complejidad que contienen cápsidas AAV con propiedades bioquímicas variadas debido a mutaciones presentes en la superficie de la cápside. Si el preparado de rAAV está destinado a la inyección en animales, especialmente en primates no humanos, es fundamental limitar la contaminación por endotoxinas. Se debe tener mucho cuidado al separar las áreas utilizadas para cultivar cultivos bacterianos de la producción de rAAV para evitar la contaminación bacteriana durante todos los pasos. Realice todo el trabajo con células humanas y AAV crudo en un gabinete de bioseguridad utilizando material de plástico desechable. Esto evita la contaminación bacteriana y es una necesidad para trabajar con AAV, ya que es un agente BSL1.
Si un laboratorio no tiene acceso a una incubadora de CO2 con un agitador, se puede utilizar el cultivo celular adherente con células HEK293 en lugar del cultivo de células en suspensión Expi293. Siga las instrucciones del fabricante para el subcultivo y utilice el protocolo de transfección descrito en Crosson et al., 201817.
Los pasos críticos en este protocolo son la transfección de Expi293, la preparación del gradiente de yodixanol y la aspiración de la fracción de yodixanol que contiene AAV. Los errores durante cualquiera de estos pasos pueden dar lugar a rendimientos subóptimos de rAAV o a la imposibilidad de producir rAAV.
La transfección de las células Expi293 es un paso crítico en la producción de rAAV utilizando este protocolo. El día de la transfección, las células se resuspenden en medio volumen de medios frescos para proporcionarles los nutrientes necesarios para recuperarse de la transfección29; La transfección es un proceso muy exigente para las células. Sin embargo, el medio acondicionado no se descarta por completo porque contiene factores de crecimiento y otros metabolitos importantes para el mantenimiento y crecimiento celular. Es fundamental que el PEI y el ADN se incuben durante diez minutos completos antes de ser aplicados a las células para formar un complejo cargado30. Sin formar un complejo con PEI, el ADN no será absorbido eficientemente por las células.
Cuando se produce rAAV, la proporción de virus que se encuentra en el medio depende de las interacciones del serotipo particular con los receptores celulares Expi293. Algunos serotipos se liberan en los medios celulares a tasas más altas que otros31, lo que requiere que las partículas virales se precipiten de los medios celulares para capturar el mayor rendimiento posible y evitar la pérdida de cualquier variante basada en la falta de afinidad por los receptores celulares Expi293. Por el contrario, el serotipo AAV2 tiene fuertes interacciones de receptores con proteoglicanos de heparán sulfato presentes en 293 células, por lo que se encuentra muy poco virus empaquetado en los medios32. Cuando produzca un derivado de AAV2, omita el paso de precipitación PEG. Para la producción de bibliotecas combinatorias de cápside o rAAV de serotipos alternativos, es apropiada la precipitación de partículas virales con PEG.
Es fundamental que el cloruro de sodio 1 M esté presente en la fracción de yodixanol al 15% para disociar las partículas agregadas de AAV durante la ultracentrifugación. La omisión de NaCl en esta fracción puede conducir a resultados no deseados, como disminuciones en la eficiencia de transducción e inmunogenicidad33. Por último, tenga mucho cuidado al aspirar el AAV del gradiente de yodixanol. La aspiración excesiva de la fracción de yodixanol puede dar lugar a la presencia de cápsidas vacías en el producto final17.
Este método se puede utilizar para empaquetar bibliotecas de cápside combinatoria rAAV para su uso en experimentos de evolución dirigidos aguas abajo para identificar cápsidas con mayor tropismo para ciertos tipos de células humanas. El rAAV es estable a 4 °C para uso a corto plazo y a -70 °C para almacenamiento a largo plazo34. Actualmente, el AAV recombinante se usa en cinco medicamentos aprobados por la FDA para tratar afecciones como la distrofia muscular de Duchenne 35,36,37. Existen varias terapias adicionales con rAAV en ensayos clínicos y preclínicos 38,39,40. Por lo tanto, la investigación adicional sobre este vector es fundamental para el desarrollo de terapias génicas adicionales.
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Disclosures
Los autores no tienen revelaciones que informar.
Acknowledgments
Ninguno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
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