Summary
Adenoassosiert virus produseres i suspensjonscellekultur og renses ved dobbel iodixanoltetthetsgradientsentrifugering. Trinn er inkludert for å øke det totale virusutbyttet, redusere risikoen for virusutfelling og ytterligere konsentrere det endelige virusproduktet. Forventede endelige titre når 1012 virale partikler/ml og er egnet for preklinisk in vivo bruk.
Abstract
Denne protokollen beskriver rekombinant adenoassosiert virus (rAAV) produksjon og rensing ved iodixanoltetthetsgradientsentrifugering, en serotype-agnostisk metode for rensing av AAV først beskrevet i 1999. rAAV-vektorer er mye brukt i genterapiapplikasjoner for å levere transgener til forskjellige humane celletyper. I dette arbeidet produseres det rekombinante viruset ved transfeksjon av Expi293-celler i suspensjonskultur med plasmider som koder for transgenet, vektorkapsid og adenovirale hjelpergener. Sentrifugering av iodiksanolgradient renser fulle AAV-partikler basert på partikkeltetthet. I tillegg er tre trinn inkludert i denne nå allestedsnærværende metodikken for å øke det totale virusutbyttet, redusere risikoen for nedbør på grunn av forurensende proteiner, og videre konsentrere det endelige virusproduktet, henholdsvis: utfelling av virale partikler fra cellemedier ved bruk av en løsning av polyetylenglykol (PEG) og natriumklorid, innføring av en andre runde av sentrifugering av jodixanoltetthetsgradient, og bufferutveksling via et sentrifugalfilter. Ved hjelp av denne metoden er det mulig å konsekvent oppnå titere i området 1012 virale partikler/ml eksepsjonell renhet for in vivo bruk.
Introduction
Rekombinante adenoassosierte virale (rAAV) vektorer er mye brukte verktøy for behandling av genetiske sykdommer, inkludert spinal muskelatrofi, retinal dystrofi og hemofili A 1,2,3. rAAV-vektorer er konstruert for å mangle virusgener tilstede i villtype AAV4, et lite, ikke-konvolutt icosahedral virus med et lineært enkeltstrenget 4,7 kb DNA-genom. AAV ble først oppdaget på 1960-tallet som forurensning av adenoviruspreparater5. Til tross for den lille kapsidstørrelsen, som begrenser størrelsen på transgenet som kan pakkes til maksimalt 4,9 kb unntatt ITR6, er AAV nyttig for transgenfødsel fordi det er ikke-patogent hos mennesker, tillater ekspresjon av transgen i mange delende og ikke-delende celletyper, og har begrensede immunogene effekter7.
Som medlemmer av slekten dependoparvovirus er produksjonen av rAAVs avhengig av uttrykket av hjelpergener tilstede i adenovirus eller herpes simplex-virus8. Det er utviklet flere strategier for å produsere rAAV, men produksjon i HEK293-celler transformert med adenovirale E1A/E1B-hjelpergener er den mest etablerte metoden som brukes i dag9. Den generelle tilnærmingen til rAAV-produksjon begynner med transfeksjon av HEK293-celler med tre plasmider som inneholder transgenet i henholdsvis inverterte terminale repetisjoner (ITR), AAV-rep - og cap-gener og ytterligere adenovirale hjelpergener. Syttito timer etter transfeksjon høstes og behandles celler for å rense rAAV som inneholder transgenet.
I utviklingen av nye rAAV-vektorer for terapeutiske formål er et hovedmål å produsere vektorer med økt transduksjonseffektivitet. En økning i transduksjonseffektiviteten til målceller vil bety en reduksjon i den nødvendige kliniske dosen av rAAV, og dermed redusere sannsynligheten for uønskede immunogene effekter fra antistoffmediert nøytralisering til akutt toksisitet10,11. For å forbedre transduksjonseffektiviteten til rAAV-vektorer, kan endringer gjøres i det pakkede genomet eller til kapsiden. Levedyktige metoder for å justere transduksjonseffektiviteten via pakket genomdesign inkluderer inkorporering av sterke og vevsspesifikke promotorer, gjennomtenkt utvalg av mRNA-prosesseringselementer og kodingssekvensoptimalisering for å forbedre oversettelseseffektiviteten12. Endringer i kapsidet er gjort med sikte på å øke tropismen for målhumane celletyper. Arbeidet med å utvikle nye rAAV-transgene leveringsvektorkapsider er generelt preget av fokus på enten rasjonell design av AAV-kapsider med spesifikke mutasjoner rettet mot spesifikke cellereseptorer eller rettet evolusjon for å identifisere kapsider med tropisme for spesifikke celletyper fra kombinatoriske kapsidbiblioteker med høy kompleksitet uten å målrette mot en spesifikk reseptor (selv om noen grupper kombinerer disse tilnærmingene)13, 14,15. I den regisserte evolusjonstilnærmingen konstrueres kombinatoriske kapsidbiblioteker ved hjelp av en bestemt serotyperyggrad med muterte variable regioner på kapsidets eksteriør16. Kombinatoriske kapsidbiblioteker er ofte konstruert fra AAV-serotyper som ikke stammer fra mennesker, noe som reduserer risikoen for allerede eksisterende immunitet ved klinisk bruk10. Derfor er rensemetoder som kan brukes på enhver serotype ideelle for å eliminere behovet for serotypespesifikk optimalisering for de mindre brukte serotypene som tjener som ryggrad for disse bibliotekene.
Iodixanol tetthet gradient sentrifugering benyttes til å rense høye titere av rAAV med høy smittsomhet17. I denne protokollen produseres rAAV i suspensjonscellekultur for å redusere arbeidsmengden som trengs for å produsere store titere av AAV. Et sentrifugeringstrinn er også inkludert for å klarcellelysat for å redusere tilstedeværelsen av forurensende proteiner og redusere risikoen for virusutfelling. Denne protokollen er en kostnadseffektiv metode for å produsere preparater av rAAV med høy renhet egnet for preklinisk bruk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sammensetningen av løsningene og bufferne som brukes i denne protokollen er angitt i tabell 1.
| Løsning | Komposisjon | |
| AAV lysis buffer | 1,2 ml 5 M NaCl-løsning | |
| 2 ml Tris-HCl pH 8,5 oppløsning | ||
| 80 uL med 1 M MgCl2-løsning | ||
| mQ vann til 40 ml | ||
| AAV nedbørsløsning | 40 g PEG 8000 | |
| 50 ml 5 M NaCl-løsning | ||
| mQ vann til 100 ml | ||
| 15% jodixanol fraksjon | 7,5 ml OptiPrep | |
| 3 ml 10X DPBS | ||
| 6 ml 5 M NaCl-løsning | ||
| 30 uL av 1 M MgCl2 løsning | ||
| mQ til 30 ml | ||
| 25% jodixanol fraksjon | 12. 5 ml OptiPrep | |
| 3 ml 10X DPBS | ||
| 30 uL av 1 M MgCl2 løsning | ||
| 60 uL fenolrød oppløsning | ||
| mQ til 30 ml | ||
| 40% jodixanol fraksjon | 33,3 ml OptiPrep | |
| 5 ml 10X DPBS | ||
| 50 uL av 1 M MgCl2 løsning | ||
| mQ til 50 ml | ||
| 60% jodixanol fraksjon | 50 ml OptiPrep | |
| 100 ul fenolrød oppløsning | ||
| AAV-bufferløsning | 8 ml av 5 m NaCl | |
| 20 uL på 10% Pluronic F-68 | ||
| PBS til 200 ml | ||
Tabell 1: Løsningssammensetninger for løsninger som brukes i denne protokollen.
1. Trippel transfeksjon av Expi293-celler
- Seed Expi293-celler (se materialtabell) med en opprinnelig tetthet på 5 x 105 levedyktige celler (vc) / ml.
- La cellene inkubere ved 37 °C med 8 % CO2 og en risterhastighet på 125 o / min til de når en tetthet på 3-5 x 106 vc / ml. Overvåk celletetthet og levedyktighet ved hjelp av trypanblå utelukkelse med en automatisert celleteller (se materialfortegnelse).
- Når celler når ønsket celletetthet, splitter du dem 1 til 10 ved å legge til nye medier slik at deres totale volum er ti ganger det opprinnelige volumet. Overfør om nødvendig celler til en større kolbe. Gå tilbake til inkubasjon.
- Fortsett å utvide celler som beskrevet i trinn 1,2-1,3 til de når en tetthet på minst 2 x 106 vc/ml i 250 ml medier i en 1 l kolbe.
- Dagen før transfeksjon, fortynn celler til 2 x 106 vc / ml i 250 ml media, og kast overflødige celler etter behov. Inkuber cellene over natten.
- På transfeksjonsdagen sentrifugerer du halvparten av cellene ved 58 x g i 5 minutter ved 18 °C. Balanser cellepelleten i samme volum (125 ml) ferskt medium. Cellens levedyktighet bør være nær 98%.
- Forbered to 50 ml koniske rør. Merk en "PEI" og den andre "DNA".
- I det koniske røret merket PEI, fortynn 1,2 ml PEI (polyetylenimin, se materialtabellen) til et totalvolum på 12,5 ml i OptiMEM-medier.
- I det koniske røret merket DNA, lag en ekvimolar løsning av plasmid-DNA til totalt 500 μg DNA i et totalt volum på 12,5 ml i OptiMEM-medier.
- Legg DNA-løsningen til PEI-løsningen, inverter flere ganger for å kombinere grundig, og la inkubere ved romtemperatur i 10 minutter.
MERK: Det er kritisk at DNA-PEI-løsningen får lov til å inkubere i hele 10 minutter for at PEI skal danne ladede komplekser med DNA. - Etter at DNA-PEI-løsningen har inkubert i 10 minutter, bruk en serologisk pipet for sakte å påføre DNA-PEImax-løsningen på Expi293-cellene. Returner de transfekterte cellene til inkubatoren og la dem inkubere i 72 timer (figur 1).
Figur 1: Expi293-celler som uttrykker GFP to dager etter transfeksjon. Etter transfeksjon med et plasmid som inneholder et gen for GFP, uttrykker Expi293-cellene forbigående eGFP. Cellemorfologien er rund. Bildet ble tatt med en eksponeringstid på 15 ms. Mikroskopbilder er anskaffet ved hjelp av et invertert mikroskop utstyrt med epi-fluorescensbelysning og et 10x / 0.30-objektiv. Skala bar = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. rAAV vektor rensing
- Etter 72 timer overfører cellene i suspensjonen til to 250 ml koniske rør og spinner dem ned ved 415 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Hell supernatantmediet i et nytt 500 ml konisk rør og oppbevar ved 0 °C på is for senere bearbeiding.
- Resuspender hver cellepellet i 10 ml AAV lysisbuffer (tabell 1). Pool de to lysatene sammen i ett av rørene. Skyll den andre slangen med ytterligere 5 ml AAV-lysisbuffer, og tilsett den deretter i de oppsamlede lysatene. Frys ved -70 °C.
MERK: Eksperimentet kan settes på pause på dette tidspunktet. Oppbevar supernatantmediet ved -70 °C i stedet for på is. - Legg til 1:4 volum AAV-utfellingsløsning til supernatantmediet fra trinn 2.2. Inverter flere ganger for å blande grundig og inkubere ved 0 °C på is i minst 2 timer eller over natten.
- Sentrifuger den inkuberte oppløsningen ved 3000 x g i 1 time ved 4 °C.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten med virusutfelling i 5 ml AAV lysisbuffer.
- Tine cellelysatet ved 37 °C i vannbad.
- Pool virusutfellingen med cellelysatet. Dette er det rå lysatet. Skyll sentrifugeringsrøret som inneholdt virusutfellingen med ytterligere 5 ml AAV lysisbuffer og basseng med rålysatet.
- Frys det rå lysatet til -70 °C, og tine deretter ved 37 °C. Gjenta denne syklusen en gang til.
MERK: Det rå lysatet må ikke stå ved 37 °C lenger enn det som er nødvendig for å tine det. - Når det er tint for tredje gang, tilsettes umiddelbart 4 μL benzonase til rålysatet, snus opp ned for å blande og ruges i 30 minutter ved 37 °C.
- Sentrifuger rålysatet i 10 minutter ved 650 x g ved 18 °C.
- Overfør supernatanten til et rent 50 ml konisk rør. Dette er det rå viruset. Kast pelleten.
- Sentrifuger råviruset i ytterligere 30 minutter ved 3000 x g ved 18 °C for å fjerne forurensende proteiner.
- Overfør supernatanten til et rent 50 ml konisk rør. Dette er det avklarte viruset.
MERK: Eksperimentet kan settes på pause på dette tidspunktet. Frys ned det avklarte viruset til -70 °C. - Sett opp flerkanals peristaltisk pumpe med fire peristaltiske rør (se Materialfortegnelse). Fest kapillærene til begge ender av hvert rør.
- Plasser kapillærene på inngangssiden av pumpen i et beger fylt med avionisert vann. Plasser kapillærene på utgangssiden av pumpen i et tomt begerglass. Kjør den peristaltiske pumpen ved 25,0 o / min for å skylle slangen med avionisert (DI) vann.
- Når den skylles grundig, tøm den peristaltiske slangen ved å kjøre pumpen til slangen bare er fylt med luft. Legg alle kapillærene på en ren, lofri tørk.
- Plasser fire ultrasentrifugerør i et stativ på utgangssiden av pumpen.
- Bruk en 10 ml serologisk pipett til forsiktig dispensering av 10 ml klargjort virus i hvert ultrasentrifugerør. Pass på at det ikke introduseres luftbobler.
MERK: Volumet av klargjort virus i hvert rør kan strekkes til opptil 12 ml per rør, om nødvendig. Reduser mengden av 60% jodixanol på riktig måte i trinn 2.25 nedenfor. - Det klargjorte viruset er underlagt med jodixanolfraksjoner (tabell 1) fra laveste tetthet til høyeste tetthet ved bruk av den peristaltiske pumpen. 15% fraksjonen legges til først, etterfulgt av 25% fraksjonen, 40% fraksjonen og til slutt 60% fraksjonen. Overfør 22 ml (5,5 ml per ultrasentrifugerør) av 15 % jodixanolfraksjonen til et rent 50 ml konisk rør. Plasser kapillærene på inngangssiden av pumpen inn i røret, og pass på at alle kapillærene berører bunnen av røret.
- Start pumpen og la slangen fylles med jodixanolfraksjonen. Når iodixanolfraksjonen når endene av kapillærene på utgangssiden av pumpen, stopp pumpen.
- Sett inn en utgangskapillær i hvert ultrasentrifugerør med avklart virus, og pass på at kapillærene berører bunnen av hvert ultrasentrifugerør.
MERK: Det er av kritisk betydning at det ikke er luft igjen i kapillærene. Iodixanol kan strømme gjennom det peristaltiske slangen med litt forskjellige hastigheter, så sørg for at hver enkelt utgangskapillær er fullstendig fylt med jodixanol før du setter den inn i det klarerte viruset. Det kan være nødvendig å stoppe og starte pumpen flere ganger. - Start pumpen og la ultrasentrifugerørene fylles. Når den siste av de 15% fraksjonen er i ferd med å bli tatt inn i inngangskapillærene, stopp pumpen. Det er kritisk at ingen luftbobler kommer inn i det peristaltiske slangen.
MERK: Hvis luftbobler kommer inn i inngangskapillærene, kan pumpen kjøres kort i motsatt retning for å skyve dem ut igjen. - Overfør 22 ml (5,5 ml per ultrasentrifugerør) av 25 % jodixanolfraksjonen til det koniske 50 ml. Pass på at alle kapillærene berører bunnen av røret og start pumpen. Når den siste av de 25% fraksjonen er i ferd med å bli tatt inn i inngangskapillærene, stopp pumpen.
- Gjenta trinn 2,24 med 20 ml (5 ml per ultrasentrifugerør) av 40 % jodixanolfraksjonen og deretter med 24 ml (6 ml per ultrasentrifugerør) av 60 % fraksjonen.
- Hvis det fortsatt er ufylt volum igjen i ultrasentrifugerøret, fortsett å legge til mer av 60% fraksjonen til ultrasentrifugerørene er fullstendig fylt med væske.
- Fyll hvert rør til lysatet gjør en kuppel over toppen, men ikke overløp fra røret. Stopp pumpen og fjern forsiktig hver utgangskapillær, pass på at jodixanolgradienten ikke forstyrres.
- Sett lokk på hvert ultrasentrifugerør med et avstandsstykke og legg det inn i en Type 70 Ti-rotor (se materialfortegnelse).
MERK: Kontroller at rotoren er riktig balansert. Ikke prøv å betjene ultrasentrifugen uten riktig opplæring. - Legg Type 70 Ti-rotoren inn i ultrasentrifugen og sentrifugatet ved 489 000 x g i 1 time ved 18 °C.
- Etter sentrifugering, last rotoren fra ultrasentrifugen. Bruk nåletang til å forsiktig fjerne hvert ultrasentrifugerør fra rotoren, og pass på at du ikke forstyrrer jodixanolgradienten.
- Bruk et støtteringstativ med klemme for å feste ett ultrasentrifugerør.
- Fest en 20 GA kanyle til en 5 ml sprøyte og sett til side. Bruk en lofri klut for å fjerne hetten fra ultrasentrifugerøret.
- Penetrer veggen av ultrasentrifugerøret med nålen ca. 3 mm under 40%-60% jodixanolgrensesnittet (figur 2).
- Sakte aspirer grensesnittet og en del av 40% fraksjonen. Unngå å aspirere toppen av 40% fraksjonen, for et totalt trekk på ca 4 ml.
- Hold en finger over den åpne toppen av ultrasentrifugerøret, trekk ut sprøyten og overfør den aspirerte AAV-fraksjonen til et 50 ml konisk rør. Kast sprøyten i en beholder for skarpe gjenstander. Kast ultrasentrifugerøret.
- Gjenta trinn 2,31-2,35 for hvert ultrasentrifugerør.
- Fortynn den aspirerte AAV-fraksjonen omtrent to ganger i AAV-lysebufferen til et volum på 40 ml.
- Skyll den peristaltiske slangen som beskrevet i trinn 2.16-2.17.
MERK: Eksperimentet kan settes på pause på dette tidspunktet. Oppbevar den fortynnede AAV-fraksjonen ved 0 °C over natten. - Legg 20 ml hver av den fortynnede AAV-fraksjonen i to nye ultrasentrifugerør.
- For den andre runden med sentrifugering av jodixanoltetthet underlegges den fortynnede AAV-fraksjonen som beskrevet ovenfor ved bruk av bare 10 ml (5 ml per ultrasentrifugerør) av 40 % fraksjon og 14 ml (7 ml per ultrasentrifugerør) av 60 % fraksjon. Gjenta trinn 2,29–2,36 for ultrasentrifugering og aspirasjon.
MERK: Før lagring av peristaltisk pumpe og slange, skyll ut slangen med DI-vann som beskrevet i trinn 2.16-2.17.
Figur 2: Iodixanol gradient med 40% -60% jodixanol grensesnitt merket. (A) Første jodixanolgradient. Fenolrødt brukes i fraksjonene 40% jodixanol og 60% jodixanol. Det ser ut som en annen farge på grunn av forskjellen i pH mellom de to fraksjonene. Pilen indikerer hvor sprøyten skal settes inn for å høste rAAV-fraksjonen, like under grensesnittet 40%-60% iodixanol. (B) Andre jodixanolgradient. Bare 40% og 60% jodixanol fraksjoner brukes i dette trinnet. Pilen indikerer hvor sprøyten skal settes inn for å høste rAAV-fraksjonen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Bufferutveksling og viruskonsentrasjon
- Etter å ha oppnådd AAV-fraksjonen fra andre runde med sentrifugering av jodixanoltetthetsgradient, fortynnes den dobbelt med AAV-bufferløsning.
- Balanser sentrifugalfilteret ved å tilsette 20 ml AAV-bufferløsning på toppen av filteret. Sentrifuger apparatet ved 3000 x g ved 18 °C i 5 minutter og kast gjennomstrømningen.
- Tilsett den fortynnede AAV-fraksjonen til sentrifugalfilteret. Sentrifuger apparatet ved 3000 x g ved 18 °C i 5 minutter og kast gjennomstrømningen.
- Tilsett 20 ml AAV-bufferløsning øverst på filteret. Sentrifuger apparatet ved 3000 x g ved 18 °C i 5 minutter og kast gjennomstrømningen.
MERK: Hvis sentrifugalfiltermembranen blir blokkert, slik at løsningen strømmer gjennom ineffektivt, bruk forsiktig en P200-mikropipette til å trekke opp og ned løsningen i toppen av filteret. Vær ekstremt forsiktig så du ikke berører filteret med mikropipettespissen. - Gjenta trinn 3.4 to ganger til.
MERK: Kontroller at AAV ikke er overkonsentrert ved å opprettholde minst 1 ml volum i toppen av filteret. Det kan være nødvendig å justere sentrifugeringstidene for å forhindre overkonsentrasjon. Hvis AAV er overkonsentrert, kan det oppstå nedbør. - For en siste titer i området 1012 vg/ml, spinn ned viruset til et endelig volum på ca. 1 ml.
MERK: Avhengig av serotyperyggraden som brukes og virusets emballasjeeffektivitet, må du kanskje konsentrere viruset i et mindre volum. - Bruk en p1000-mikropipette til å overføre konsentrert AAV fra toppen av sentrifugalfilteret til et mikrosentrifugerør. Bruk en p200-mikropipette til å vaske sentrifugalfilteret med 50 μL AAV-buffer for å samle opp eventuelle gjenværende virus og samle sammen resten av konsentrert AAV.
- Sett til side en 2 μL alikot av konsentrert AAV for titrering. Se tilleggstabell 1 for å se ITR-primere som kan brukes til qPCR.
- Før den konsentrerte AAV gjennom et 0,2 μm sprøytefilter for å sterilisere den.
MERK: Når du steriliserer et lite volum, må du passe på å velge et sprøytefilter med liten diameter for å minimere virustap. Bruk av et lavproteinbindingsfilter med liten diameter vil resultere i minimalt virustap (data ikke vist). - Den steriliserte AAV kan brukes umiddelbart til å transdusere celler eller oppbevares ved 4 °C for bruk innen fire uker. Den bør oppbevares ved -70 °C for langtidslagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne metoden kan brukes til å oppnå titere på minst 1012 virale partikler per ml. En titer kan fås (figur 3) ved qPCR ved bruk av ITR-primerne gitt i tilleggstabell 1, ved ddPCR eller ved en hvilken som helst annen titreringmetode. Suboptimale titere kan skyldes bruk av et cap-gen som koder for et kapsid med dårlig emballasjeeffektivitet.
En annen mulig kilde til suboptimale resultater er den dårlige transduksjonseffektiviteten til Expi293-celler. Det anbefales å ha celler med en tetthet på 3-4 x 106 vc / ml på transfeksjonsdagen og at cellens levedyktighet er nær 98%. I denne studien fikk forfatterne en titer på 1,07 x 1012 vg etter denne protokollen. Dette utbyttet samsvarer med tidligere avkastning oppnådd fra emballasje AAVrh7418.
Figur 3: Titerbestemmelse ved qPCR. Kurve 1 ble generert med en standardkonsentrasjon på 3,66 x 1011 vg/ml, kurve 2 ble generert med en standardkonsentrasjon på 3,66 x 1010 vg/ml, kurve 3 var den endelige konsentrerte AAV-prøven, kurve 4 ble generert med en standardkonsentrasjon på 3,66 x 109 vg/ml, og kurve 5 ble generert med en standardkonsentrasjon på 3,66 x 108 vg/ml. Hver qPCR-reaksjon ble utført i to eksemplarer. (A) qPCR-amplifikasjonskurve. Standarder ble generert ved seriell fortynning av en AAV-standard tittered av ddPCR. Konsentrasjonen av ufortynnet standard var 3,66 x 1012 vg/ml. (B) Standardkurve generert av qPCR. Den produserte AAV ble bestemt til å ha en konsentrasjon på 1,85 x 1011 vg / ml i 5,75 ml, for en total avkastning på 1,07 x 1012 vg. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell 1: Primersekvenser forover og bakover for AAV-inverterte terminalrepetisjoner (ITR). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den doble renseprotokollen for jodixanolgradient er den universelle metoden fordi den kan brukes på alle AAV-muterte varianter, uavhengig av reseptorspesifisitet. Tidlige metoder for AAV-rensing baserte seg på partikkeltetthet og inkluderte isopycnic sentrifugering i CsCl og kontinuerlig sukrose tetthet gradient sentrifugering19. Senere ble serotypespesifikke tilnærminger utviklet, som benyttet monoklonale antistoffer bundet til Sepharose-kolonnene20. En ny tetthetsbasert rensemetode med diskontinuerlig jodixanolgradient ble utviklet i 1999 og ga AAV-isolater med høyere smittsomhet enn isolerte fra CsCl-gradienter21. Metoder for rensing av AAV fortsatte å bli utviklet tidlig på 2000-tallet, da noen grupper brukte høytytende væskekromatografi for å rense rAAV med utvinning fra rålysat på over 70%22,23,24. Disse metodene brukes fortsatt i storskala produksjonsprosesser25. Til tross for utviklingen av kromatografimetoder for isolering av AAV, er rensing ved iodixanoltetthetsgradientsentrifugering fortsatt mye brukt på grunn av lavere kostnad og serotypeagnostisisme26,27.
Selv om denne metoden er godt egnet for tidseffektiv preklinisk produksjon av rAAV, er den svært begrenset i skalerbarhet og evne til å tilpasses cGMP-produksjon25. Således, som beskrevet ovenfor, foretrekkes andre rensemetoder for storskala produksjon. I tillegg er transgenkapasiteten til rAAV-vektorer begrenset. Størrelsesgrensen for et AAV-genom som kan pakkes intakt har vist seg å være ca. 5,2 kb, for en maksimal transgenstørrelse på 4,9 kb, regnet med ITR6. Dette kompliserer ekspresjonen av proteiner hvis cDNA overskrider denne kapasiteten. Disse proteinene kan ikke uttrykkes av systemet beskrevet her uten modifikasjon av selve transgenet eller bruk av et delt vektorsystem. Chamberlain et al. beskriver flere metoder for å uttrykke transgener større enn 4,9 kb28.
Denne metoden er spesielt nyttig for produksjon av kombinatoriske kapsidbiblioteker med høy kompleksitet som inneholder AAV-kapsider med varierte biokjemiske egenskaper på grunn av mutasjoner tilstede på kapsidoverflaten. Hvis rAAV-preparatet er bestemt for injeksjon til dyr, spesielt hos primater som ikke er mennesker, er det avgjørende å begrense endotoksinforurensning. Det må utvises stor forsiktighet for å skille områder som brukes til å dyrke bakteriekulturer fra rAAV-produksjonen for å forhindre bakteriell forurensning under alle trinn. Utfør alt arbeid med menneskeceller og rå AAV i et biosikkerhetsskap ved bruk av engangs plastvarer. Dette forhindrer bakteriell forurensning og er en nødvendighet for å jobbe med AAV, da det er et BSL1-middel.
Hvis et laboratorium ikke har tilgang til en CO2 -inkubator med en shaker, kan adherent cellekultur med HEK293-celler brukes i stedet for Expi293 suspensjonscellekultur. Følg produsentens instruksjoner for subkulturering og bruk transfeksjonsprotokollen beskrevet i Crosson et al., 2018:17.
Kritiske trinn i denne protokollen er Expi293-transfeksjon, fremstilling av jodixanolgradienten og aspirasjon av jodixanolfraksjonen som inneholder AAV. Feil under noen av disse trinnene kan føre til suboptimale rAAV-utbytter eller manglende produksjon av rAAV.
Transfeksjon av Expi293-cellene er et kritisk trinn i produksjonen av rAAV ved hjelp av denne protokollen. På transfeksjonsdagen blir cellene resuspendert i et halvt volum ferske medier for å gi dem næringsstoffene som er nødvendige for å gjenopprette fra transfeksjon29; Transfeksjon er en veldig belastende prosess for cellene. Imidlertid er det kondisjonerte mediet ikke helt kassert fordi det inneholder vekstfaktorer og andre metabolitter som er viktige for cellevedlikehold og vekst. Det er kritisk at PEI og DNA inkuberer i hele ti minutter før de påføres celler for å danne et ladet kompleks30. Uten å danne et kompleks med PEI, vil DNA ikke bli effektivt tatt opp av celler.
Ved fremstilling av rAAV avhenger andelen virus som finnes i mediet av den bestemte serotypens interaksjoner med Expi293-cellereseptorer. Noen serotyper frigjøres i cellemedier med høyere hastigheter enn andre31, noe som nødvendiggjør at virale partikler utfelles fra cellemedier for å fange høyest mulig utbytte og forhindre tap av varianter basert på mangel på affinitet for Expi293-cellereseptorer. I motsetning til dette har serotypen AAV2 sterke reseptorinteraksjoner med heparansulfatproteoglykaner tilstede i 293 celler, så svært lite pakket virus finnes i media32. Når du produserer et derivat av AAV2, utelater du PEG-utfellingstrinnet. For produksjon av kombinatoriske kapsidbiblioteker eller rAAV av alternative serotyper er utfelling av virale partikler med PEG hensiktsmessig.
Det er kritisk at 1 M natriumklorid er tilstede i 15 % jodixanolfraksjonen for å fjerne aggregerte AAV-partikler under ultrasentrifugering. Utelatelse av NaCl i denne fraksjonen kan føre til uønskede resultater, for eksempel reduksjon i transduksjonseffektivitet og immunogenitet33. Til slutt, vær nøye med å aspirere AAV fra jodixanolgradienten. Aspirasjon av for mye av jodixanolfraksjonen kan resultere i tilstedeværelse av tomme kapsider i sluttproduktet17.
Denne metoden kan brukes til å pakke rAAV kombinatoriske kapsidbiblioteker for bruk i nedstrømsrettede evolusjonseksperimenter for å identifisere kapsider med høyere tropisme for visse humane celletyper. rAAV er stabil ved 4 °C for kortvarig bruk og ved -70 °C for langtidslagring34. For tiden er den rekombinante AAV i bruk i fem FDA-godkjente medisiner som behandler tilstander, inkludert Duchenne muskeldystrofi 35,36,37. Det finnes flere ekstra rAAV-behandlinger i kliniske og prekliniske studier 38,39,40. Videre forskning på denne vektoren er derfor avgjørende for utviklingen av ytterligere genterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen avsløringer å rapportere.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
- Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
- Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration. BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).
- George, L. A., et al. Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A. N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy. Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. cD.
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).
- Zolotukhin, S. Production of recombinant adeno-associated virus vectors. Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).
- Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N., Ayuso, E. Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production. Mol Ther - Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).
- Costa-Verdera, H., et al. Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).
- Ertl, H. C. J. Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression. Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).
- Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
- Marsic, D., et al. Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants. Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).
- Grimm, D., Zolotukhin, S. E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution. Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).
- Biswas, M., et al. Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity. Mol Ther - Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).
- Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).
- Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation. Mol Ther - Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).
- Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting. Viruses. 15 (11), 2168 (2023).
- Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis. Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
- Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Debelak, D., et al. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2. J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).
- Burova, E., Ioffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
- Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).
- Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids. Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).
- Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein. BMC Biotechnol. 23 (1), 7 (2023).
- Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability. Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
- Wright, J. F., et al. Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation. Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).
- Gruntman, A. M., et al. Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).
- Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
- Mullard, A. FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections. Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).
- Center for Biologics Evaluation and Research. Approved Cellular and Gene Therapy Products. US Food Drug Adm. , (2023).
- Kang, L., et al. AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges. J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).
- De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Hemophilia gene therapy: The end of the beginning. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).
- Simons, E. J., Trapani, I. The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).
