Summary
Adeno-geassocieerd virus wordt geproduceerd in suspensiecelkweek en gezuiverd door centrifugatie met dubbele jodixanoldichtheidsgradiënt. Er zijn stappen opgenomen om de totale virusopbrengst te verhogen, het risico op virusneerslag te verminderen en het uiteindelijke virusproduct verder te concentreren. De verwachte uiteindelijke titers bereiken 10tot 12 virale deeltjes/ml en zijn geschikt voor preklinisch in vivo gebruik.
Abstract
Dit protocol beschrijft de productie en zuivering van recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) door middel van jodixanoldichtheidsgradiëntcentrifugatie, een serotype-agnostische methode om AAV te zuiveren die voor het eerst werd beschreven in 1999. rAAV-vectoren worden veel gebruikt in gentherapietoepassingen om transgenen af te leveren aan verschillende menselijke celtypen. In dit werk wordt het recombinante virus geproduceerd door transfectie van Expi293-cellen in suspensiecultuur met plasmiden die coderen voor de transgen-, vectorcapside- en adenovirale helpergenen. Iodixanol dichtheidsgradiëntcentrifugatie zuivert volledige AAV-deeltjes op basis van deeltjesdichtheid. Bovendien zijn er drie stappen opgenomen in deze nu alomtegenwoordige methodologie om de totale virusopbrengst te verhogen, het risico op neerslag als gevolg van besmettende eiwitten te verminderen en het uiteindelijke virusproduct verder te concentreren, respectievelijk: precipitatie van virale deeltjes uit celmedia met behulp van een oplossing van polyethyleenglycol (PEG) en natriumchloride, de introductie van een tweede ronde van jodixanoldichtheidsgradiëntcentrifugatie, en bufferuitwisseling via een centrifugaalfilter. Met behulp van deze methode is het mogelijk om consistent titers te bereiken in het bereik van 1012 virale deeltjes/ml met een uitzonderlijke zuiverheid voor in vivo gebruik.
Introduction
Recombinante adeno-geassocieerde virale (rAAV) vectoren zijn veelgebruikte hulpmiddelen voor de behandeling van genetische ziekten, waaronder spinale musculaire atrofie, retinale dystrofie en hemofilie A 1,2,3. rAAV-vectoren zijn zo gemanipuleerd dat ze geen virale genen hebben die aanwezig zijn in wildtype AAV4, een klein, niet-envelop icosahedraal virus met een lineair enkelstrengs DNA-genoom van 4,7 kb. AAV werd voor het eerst ontdekt in de jaren 1960 als een verontreiniging van adenoviruspreparaten. Ondanks de kleine capside-grootte, die de grootte van het transgen dat kan worden verpakt beperkt tot maximaal 4,9 kb exclusief ITR's6, is AAV nuttig voor transgenafgifte omdat het niet-pathogeen is bij mensen, expressie van transgen mogelijk maakt in veel delende en niet-delende celtypen en beperkte immunogene effecten heeft7.
Als leden van het geslacht dependoparvovirus is de productie van rAAV's afhankelijk van de expressie van helpergenen die aanwezig zijn in adenovirus of herpes simplex-virus8. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om rAAV te produceren, maar de productie in HEK293-cellen die zijn getransformeerd met de adenovirale E1A/E1B-helpergenen is de meest gevestigde methode die tegenwoordig wordt gebruikt. De algemene benadering van rAAV-productie begint met de transfectie van HEK293-cellen met drie plasmiden die het transgen bevatten in respectievelijk omgekeerde terminale herhalingen (ITR's), AAV-rep- en cap-genen en aanvullende adenovirale helpergenen. Tweeënzeventig uur na transfectie worden cellen geoogst en verwerkt om rAAV te zuiveren die het transgen bevat.
Bij de ontwikkeling van nieuwe rAAV-vectoren voor therapeutische doeleinden is een belangrijk doel het produceren van vectoren met een verhoogde transductie-efficiëntie. Een toename van de transductie-efficiëntie van doelcellen zou een verlaging van de noodzakelijke klinische dosis rAAV betekenen, waardoor de kans op nadelige immunogene effecten, variërend van antilichaam-gemedieerde neutralisatie tot acute toxiciteiten, wordt verkleind10,11. Om de transductie-efficiëntie van rAAV-vectoren te verbeteren, kunnen wijzigingen worden aangebracht in het verpakte genoom of in de capside. Haalbare methoden om de werkzaamheid van transductie af te stemmen via verpakt genoomontwerp zijn onder meer de integratie van sterke en weefselspecifieke promotors, doordachte selectie van mRNA-verwerkingselementen en optimalisatie van coderingssequenties om de translatie-efficiëntie te verbeteren12. Wijzigingen aan de capside worden aangebracht met als doel het tropisme voor menselijke doelceltypen te vergroten. Inspanningen om nieuwe rAAV-capsiden voor transgenafgifte te ontwikkelen, worden over het algemeen gekenmerkt door een focus op ofwel rationeel ontwerp van AAV-capsiden met specifieke mutaties gericht op specifieke celreceptoren, ofwel gerichte evolutie om capsiden met tropisme te identificeren voor specifieke celtypen uit combinatorische capsidebibliotheken met hoge complexiteit zonder zich te richten op één specifieke receptor (hoewel sommige groepen deze benaderingen combineren)13, 14,15. In de gerichte evolutiebenadering worden combinatorische capsidebibliotheken geconstrueerd met behulp van een bepaalde serotype-ruggengraat met gemuteerde variabele regio's aan de buitenkant van de capside16. Combinatorische capsidebibliotheken zijn vaak opgebouwd uit AAV-serotypen die niet van mensen afkomstig zijn, waardoor het risico op reeds bestaande immuniteit tijdens klinisch gebruik afneemt10. Daarom zijn zuiveringsmethoden die op elk serotype kunnen worden toegepast, ideaal om de noodzaak van serotype-specifieke optimalisatie voor de minder vaak gebruikte serotypen die als ruggengraat voor deze bibliotheken dienen, te elimineren.
Centrifugatie met de dichtheidsgradiënt van Iodixanol wordt gebruikt om hoge titers van rAAV met een hoge besmettelijkheid te zuiveren17. In dit protocol wordt rAAV geproduceerd in suspensiecelkweek om de hoeveelheid arbeid die nodig is om grote titers van AAV te produceren te verminderen. Er is ook een centrifugatiestap opgenomen om cellysaat te zuiveren om de aanwezigheid van verontreinigende eiwitten te verminderen en het risico op virusneerslag te verminderen. Dit protocol is een kosteneffectieve methode om preparaten met een hoge zuiverheid rAAV te produceren die geschikt zijn voor preklinisch gebruik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De samenstelling van de oplossingen en buffers die in dit protocol worden gebruikt, is weergegeven in tabel 1.
| Oplossing | Compositie | |
| AAV-lysisbuffer | 1,2 ml 5 M NaCl-oplossing | |
| 2 ml van 1 M Tris-HCl pH 8,5-oplossing | ||
| 80 uL 1 M MgCl2-oplossing | ||
| mQ water tot 40 ml | ||
| AAV-neerslagoplossing | 40 g PEG 8000 | |
| 50 ml 5 M NaCl-oplossing | ||
| mQ water tot 100 ml | ||
| 15% jodixanol fractie | 7,5 ml OptiPrep | |
| 3 ml 10x DPBS | ||
| 6 ml 5 M NaCl-oplossing | ||
| 30 uL 1 M MgCl2-oplossing | ||
| mQ tot 30 ml | ||
| 25% jodixanol fractie | 12. 5 ml OptiPrep | |
| 3 ml 10x DPBS | ||
| 30 uL 1 M MgCl2-oplossing | ||
| 60 uL fenolrode oplossing | ||
| mQ tot 30 ml | ||
| 40% jodixanolfractie | 33,3 ml OptiPrep | |
| 5 ml 10x DPBS | ||
| 50 uL 1 M MgCl2-oplossing | ||
| mQ tot 50 ml | ||
| 60% jodixanolfractie | 50 ml OptiPrep | |
| 100 uL fenolrode oplossing | ||
| AAV-bufferoplossing | 8 ml van 5 M NaCl | |
| 20 uL 10% Pluronic F-68 | ||
| PBS tot 200 ml | ||
Tabel 1: Samenstelling van de oplossing voor de oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
1. Drievoudige transfectie van Expi293-cellen
- Zaad Expi293-cellen (zie materiaaltabel) bij een aanvangsdichtheid van 5 x 105 levensvatbare cellen (vc)/ml.
- Laat de cellen incuberen bij 37 °C met 8% CO2 en een schudsnelheid van 125 omw/min tot ze een dichtheid van 3-5 x 106 vc/ml hebben bereikt. Bewaak de celdichtheid en levensvatbaarheid met behulp van trypanblauwe uitsluiting met een geautomatiseerde celteller (zie Tabel met materialen).
- Wanneer cellen de gewenste celdichtheid bereiken, splitst u ze 1 tot 10 door nieuwe media toe te voegen, zodat hun totale volume tien keer zo groot is als hun oorspronkelijke volume. Breng indien nodig de cellen over in een grotere kolf. Keer terug naar de incubatie.
- Ga door met het uitbreiden van de cellen zoals beschreven in de stappen 1.2-1.3 totdat ze een dichtheid hebben bereikt van ten minste 2 x 106 vc/ml in 250 ml media in een kolf van 1 l.
- Verdun de cellen de dag voor de transfectie tot 2 x 106 vc/ml in 250 ml media en gooi overtollige cellen indien nodig weg. Incubeer de cellen een nacht.
- Centrifugeer op de dag van transfectie de helft van de cellen bij 58 x g gedurende 5 minuten bij 18 °C. Resuspendeer de celpellet in hetzelfde volume (125 ml) vers medium. De levensvatbaarheid van de cel moet bijna 98% zijn.
- Bereid twee conische buizen van 50 ml voor. Label de ene "PEI" en de andere "DNA".
- Verdun in de conische buis met het label PEI 1,2 ml PEI (polyethyleenimine, zie materiaaltabel) tot een totaal volume van 12,5 ml in OptiMEM-media.
- Bereid in de conische buis met het label DNA een equimolaire oplossing van plasmide-DNA tot een totaal van 500 μg DNA in een totaal volume van 12,5 ml in OptiMEM-media.
- Voeg de DNA-oplossing toe aan de PEI-oplossing, keer meerdere keren om om grondig te combineren en laat 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de DNA-PEI-oplossing de volledige 10 minuten kan incuberen, zodat PEI geladen complexen met het DNA kan vormen. - Nadat de DNA-PEI-oplossing gedurende 10 minuten is geïncubeerd, gebruikt u een serologische pipet om de DNA-PEImax-oplossing langzaam op de Expi293-cellen aan te brengen. Plaats de getransfecteerde cellen terug in de incubator en laat ze 72 uur incuberen (Figuur 1).
Figuur 1: Expi293-cellen die GFP tot expressie brengen twee dagen na transfectie. Na transfectie met een plasmide dat een gen voor GFP bevat, brengen de Expi293-cellen tijdelijk eGFP tot expressie. De celmorfologie is rond. Het beeld is gemaakt met een belichtingstijd van 15 ms. Microscoopbeelden worden verkregen met behulp van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met epifluorescentieverlichting en een 10x/0,30 objectief. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. rAAV-vectorzuivering
- Breng de cellen na 72 uur in suspensie over in twee conische buizen van 250 ml en draai ze gedurende 10 minuten bij 4 °C rond bij 415 x g .
- Giet het bovendrijvende medium in een verse conische buis van 500 ml en bewaar bij 0 °C op ijs voor latere verwerking.
- Resuspendeer elke celpellet in 10 ml AAV-lysisbuffer (tabel 1). Bundel de twee lysaten samen in een van de buizen. Spoel de andere buis af met nog eens 5 ml AAV-lysisbuffer en voeg deze vervolgens toe aan de gepoolde lysaten. Vries in bij -70 °C.
OPMERKING: Het experiment kan op dit punt worden gepauzeerd. Bewaar het supernatans media bij -70 °C in plaats van op ijs. - Voeg 1:4 volume AAV-neerslagoplossing toe aan de supernatans media uit stap 2.2. Keer meerdere keren om om grondig te mengen en incubeer bij 0 °C op ijs gedurende ten minste 2 uur of een nacht.
- Centrifugeer de geïncubeerde oplossing bij 3000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Gooi het supernatans weg en resuspendeer de pellet met viraal neerslag in 5 ml AAV-lysisbuffer.
- Ontdooi het cellysaat bij 37 °C in een waterbad.
- Pool het virale neerslag met het cellysaat. Dit is het ruwe lysaat. Spoel de centrifugatiebuis die het virale neerslag bevatte met een extra 5 ml AAV-lysisbuffer en plas op met het ruwe lysaat.
- Vries het ruwe lysaat in tot -70 °C en ontdooi het bij 37 °C. Herhaal deze cyclus nog een keer.
OPMERKING: Het ruwe lysaat mag niet langer op 37 °C worden bewaard dan nodig is om het te ontdooien. - Eenmaal ontdooid voor de derde keer, onmiddellijk 4 μL benzonase toevoegen aan het ruwe lysaat, omkeren om te mengen en 30 minuten incuberen bij 37 °C.
- Centrifugeer het ruwe lysaat gedurende 10 minuten bij 650 x g bij 18 °C.
- Breng het supernatans over in een schone conische buis van 50 ml. Dit is het ruwe virus. Gooi de pellet weg.
- Centrifugeer het ruwe virus nog eens 30 minuten bij 3000 x g bij 18 °C om besmettende eiwitten te verwijderen.
- Breng het supernatans over in een schone conische buis van 50 ml. Dit is het opgehelderde virus.
OPMERKING: Het experiment kan op dit punt worden gepauzeerd. Bevries het geklaarde virus tot -70 °C. - Stel de meerkanaals slangenpomp in met vier slangen (zie Materiaaltabel). Bevestig haarvaten aan beide uiteinden van elke buis.
- Plaats de capillairen aan de ingangszijde van de pomp in een bekerglas gevuld met gedeïoniseerd water. Plaats de capillairen aan de uitvoerzijde van de pomp in een lege beker. Laat de peristaltische pomp draaien op 25.0 tpm om de slang door te spoelen met gedeïoniseerd (DI) water.
- Wanneer de slangen grondig zijn doorgespoeld, maakt u de peristaltische slang leeg door de pomp te laten draaien totdat de slang alleen met lucht is gevuld. Leg alle haarvaten op een schoon, pluisvrij doekje.
- Plaats vier ultracentrifugebuisjes in een rek aan de uitgangszijde van de pomp.
- Gebruik een serologische pipet van 10 ml om voorzichtig 10 ml geklaard virus in elke ultracentrifugebuis te doseren. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen komen.
OPMERKING: Het volume van het geklaarde virus in elk buisje kan indien nodig worden opgerekt tot maximaal 12 ml per buisje. Verlaag de hoeveelheid 60% jodixanol op de juiste manier in stap 2.25 hieronder. - Het geklaarde virus wordt met behulp van de peristaltische pomp bedekt met jodixanolfracties (tabel 1) van de laagste dichtheid naar de hoogste dichtheid. De 15%-fractie wordt eerst toegevoegd, gevolgd door de 25%-fractie, de 40%-fractie en ten slotte de 60%-fractie. Breng 22 ml (5,5 ml per ultracentrifugebuisje) van de 15% jodixanolfractie over in een schoon conisch buisje van 50 ml. Plaats de capillairen aan de ingangszijde van de pomp in de slang en zorg ervoor dat alle capillairen de bodem van de slang raken.
- Start de pomp en laat de slang zich vullen met de jodixanolfractie. Wanneer de jodixanolfractie de uiteinden van de haarvaten aan de uitgangszijde van de pomp bereikt, stopt u de pomp.
- Steek een uitgangscapillair in elke ultracentrifugebuisjes met geklaard virus en zorg ervoor dat de haarvaten de bodem van elke ultracentrifugebuis raken.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat er geen lucht meer in de haarvaten zit. Iodixanol kan met iets verschillende snelheden door de peristaltische slang stromen, dus zorg ervoor dat elk afzonderlijk uitgangscapillair volledig is gevuld met jodixanol voordat u het in het geklaarde virus inbrengt. Het kan nodig zijn om de pomp meerdere keren te stoppen en te starten. - Start de pomp en laat de ultracentrifugebuisjes zich vullen. Wanneer de laatste van de 15% fractie op het punt staat in de ingaande capillairen te worden opgenomen, stopt u de pomp. Het is van cruciaal belang dat er geen luchtbellen in de peristaltische slang komen.
NOTITIE: Als er luchtbellen in de ingaande capillairen komen, kan de pomp kort in omgekeerde richting worden gedraaid om ze weer naar buiten te duwen. - Breng 22 ml (5,5 ml per ultracentrifugebuisje) van de 25% jodixanolfractie over in de conische buis van 50 ml. Zorg ervoor dat alle haarvaten de onderkant van de slang raken en start de pomp. Wanneer de laatste van de 25% fractie op het punt staat in de ingaande capillairen te worden opgenomen, stopt u de pomp.
- Herhaal stap 2.24 met 20 ml (5 ml per ultracentrifugebuisje) van de 40% jodixanolfractie en vervolgens met 24 ml (6 ml per ultracentrifugebuisje) van de 60%-fractie.
- Als er nog ongevuld volume in de ultracentrifugebuis zit, blijf dan meer van de 60%-fractie toevoegen totdat de ultracentrifugebuisjes volledig gevuld zijn met vloeistof.
- Vul elke buis totdat het lysaat een koepel over de bovenkant maakt, maar niet uit de buis overloopt. Stop de pomp en verwijder voorzichtig elk capillair aan de uitgang, waarbij u ervoor zorgt dat u de jodixanolgradiënt niet verstoort.
- Sluit elke ultracentrifugebuis af met een afstandhouder en laad deze in een rotor van het type 70 Ti (zie Materiaaltabel).
NOTITIE: Zorg ervoor dat de rotor goed is uitgebalanceerd. Probeer de ultracentrifuge niet te bedienen zonder de juiste training. - Laad de rotor van het type 70 Ti in de ultracentrifuge en centrifugeer gedurende 1 uur bij 18 °C bij 489.000 x g .
- Na het centrifugeren ontlaadt u de rotor uit de ultracentrifuge. Gebruik een punttang om elke ultracentrifugebuis voorzichtig van de rotor te verwijderen en zorg ervoor dat u de jodixanolgradiënt niet verstoort.
- Gebruik een steunringstandaard met klem om één ultracentrifugebuis vast te zetten.
- Bevestig een naald van 20 GA aan een spuit van 5 ml en zet apart. Gebruik een pluisvrij doekje om de dop van de ultracentrifugebuis te verwijderen.
- Penetreer de wand van de ultracentrifugebuis met de naald ongeveer 3 mm onder de 40%-60% jodixanol-interface (Figuur 2).
- Zuig de interface en een deel van de 40%-fractie langzaam op. Vermijd het opzuigen van de bovenkant van de 40%-fractie, voor een totale afname van ongeveer 4 ml.
- Houd een vinger boven de open bovenkant van de ultracentrifugebuis, trek de spuit eruit en breng de aangezogen AAV-fractie over in een conische buis van 50 ml. Gooi de spuit weg in een naaldencontainer. Gooi de ultracentrifugebuis weg.
- Herhaal stap 2.31-2.35 voor elke ultracentrifugebuis.
- Verdun de aangezogen AAV-fractie ongeveer tweevoudig in AAV-lysisbuffer tot een volume van 40 ml.
- Spoel de peristaltische slang door zoals beschreven in de stappen 2.16-2.17.
OPMERKING: Het experiment kan op dit punt worden gepauzeerd. Bewaar de verdunde AAV-fractie een nacht bij 0 °C. - Laad elk 20 ml van de verdunde AAV-fractie in twee nieuwe ultracentrifugebuisjes.
- Voor de tweede ronde van jodixanoldichtheidsgradiëntcentrifugatie wordt de verdunde AAV-fractie ondergelegd zoals hierboven beschreven met slechts 10 ml (5 ml per ultracentrifugebuis) van de 40%-fractie en 14 ml (7 ml per ultracentrifugebuis) van de 60%-fractie. Herhaal stap 2.29-2.36 voor ultracentrifugatie en aspiratie.
NOTITIE: Voordat u de peristaltische pomp en slangen opbergt, spoelt u de slang uit met DI-water zoals beschreven in stappen 2.16-2.17.
Figuur 2: Iodixanol-gradiënt met 40%-60% jodixanol-interface gelabeld. (A) Eerste gradiënt van jodixanol. Fenolrood wordt gebruikt in de fracties van 40% jodixanol en 60% jodixanol. Het ziet eruit als een andere kleur vanwege het verschil in pH tussen de twee fracties. De pijl geeft aan waar de spuit moet worden ingebracht om de rAAV-fractie te oogsten, net onder de 40%-60% jodixanol-interface. (B) Tweede gradiënt van jodixanol. In deze stap worden alleen de 40% en 60% jodixanolfracties gebruikt. De pijl geeft aan waar de spuit moet worden ingebracht om de rAAV-fractie te oogsten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Bufferuitwisseling en virusconcentratie
- Na het verkrijgen van de AAV-fractie uit de tweede ronde van de centrifugatie met jodixanoldichtheidsgradiënt, verdunt u deze tweevoudig met AAV-bufferoplossing.
- Breng het centrifugaalfilter in evenwicht door 20 ml AAV-bufferoplossing toe te voegen aan de bovenkant van het filter. Centrifugeer het apparaat gedurende 5 minuten bij 3000 x g bij 18 °C en gooi de doorstroming weg.
- Voeg de verdunde AAV-fractie toe aan het centrifugaalfilter. Centrifugeer het apparaat gedurende 5 minuten bij 3000 x g bij 18 °C en gooi de doorstroming weg.
- Voeg 20 ml AAV-bufferoplossing toe aan de bovenkant van het filter. Centrifugeer het apparaat gedurende 5 minuten bij 3000 x g bij 18 °C en gooi de doorstroming weg.
NOTITIE: Als het centrifugaalfiltermembraan verstopt raakt, waardoor de oplossing er inefficiënt doorheen stroomt, gebruik dan voorzichtig een P200-micropipet om de oplossing in de bovenkant van het filter op en neer te zuigen. Zorg ervoor dat u het filter niet aanraakt met de punt van de micropipet. - Herhaal stap 3.4 nog twee keer.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de AAV niet te geconcentreerd is door ten minste 1 ml volume in de bovenkant van het filter te houden. Het kan nodig zijn om de centrifugatietijden aan te passen om overconcentratie te voorkomen. Als AAV overgeconcentreerd is, kan er neerslag optreden. - Voor een laatste titer in het bereik van 1012 vg/ml, verlaagt u het virus tot een eindvolume van ongeveer 1 ml.
OPMERKING: Afhankelijk van de gebruikte ruggengraat van het serotype en de verpakkingsefficiëntie van het virus, moet u het virus mogelijk in een kleiner volume concentreren. - Gebruik een p1000-micropipet om de geconcentreerde AAV van de bovenkant van het centrifugaalfilter over te brengen naar een microcentrifugebuis. Gebruik een p200-micropipet om het centrifugaalfilter te wassen met 50 μL AAV-buffer om eventueel achtergebleven virus op te vangen en samen te voegen met de rest van de geconcentreerde AAV.
- Houd een aliquot van 2 μl van de geconcentreerde AAV opzij voor titeren. Zie aanvullende tabel 1 om ITR-primers te bekijken die kunnen worden gebruikt voor qPCR.
- Haal de geconcentreerde AAV door een spuitfilter van 0,2 μm om het te steriliseren.
OPMERKING: Wanneer u een klein volume steriliseert, zorg er dan voor dat u een spuitfilter met een kleine diameter kiest om virusverlies tot een minimum te beperken. Het gebruik van een eiwitarm bindend filter met een kleine diameter zal resulteren in minimaal viraal verlies (gegevens niet getoond). - De gesteriliseerde AAV kan onmiddellijk worden gebruikt om cellen te transduceren of worden bewaard bij 4 °C voor gebruik binnen vier weken. Het moet worden bewaard bij -70 °C voor opslag op langere termijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze methode kan worden gebruikt om titers van ten minste 1012 virale deeltjes per ml te verkrijgen. Een titer kan worden verkregen (figuur 3) door qPCR met behulp van de ITR-primers in aanvullende tabel 1, door ddPCR of door een andere titermethode. Suboptimale titers kunnen het gevolg zijn van het gebruik van een cap-gen dat codeert voor een capside met een slechte verpakkingsefficiëntie.
Een andere mogelijke bron van suboptimale resultaten is de slechte transductie-efficiëntie van Expi293-cellen. Het wordt aanbevolen om cellen te hebben met een dichtheid van 3-4 x 106 vc/ml op de dag van transfectie en dat de levensvatbaarheid van de cel bijna 98% is. In de huidige studie verkregen de auteurs een titer van 1,07 x 1012 vg volgens dit protocol. Deze opbrengst komt overeen met eerdere opbrengsten verkregen uit verpakking AAVrh7418.
Figuur 3: Titerbepaling door middel van qPCR. Curve 1 werd gegenereerd met een standaardconcentratie van 3,66 x 1011 vg/ml, curve 2 werd gegenereerd met een standaardconcentratie van 3,66 x 1010 vg/ml, curve 3 was het uiteindelijke geconcentreerde AAV-monster, curve 4 werd gegenereerd met een standaardconcentratie van 3,66 x 109 vg/ml en curve 5 werd gegenereerd met een standaardconcentratie van 3,66 x 108 vg/ml. Elke qPCR-reactie werd in tweevoud uitgevoerd. (A) qPCR-amplificatiecurve. Standaarden werden gegenereerd door seriële verdunning van een AAV-standaard die werd getitterd door ddPCR. De concentratie van de onverdunde standaard was 3,66 x 1012 vg/ml. (B) Standaardcurve gegenereerd door qPCR. De geproduceerde AAV werd vastgesteld met een concentratie van 1,85 x 1011 vg/ml in 5,75 ml, voor een totale opbrengst van 1,07 x 1012 vg. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Voorwaartse en achterwaartse primersequenties voor AAV-omgekeerde terminalherhalingen (ITR's). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het zuiveringsprotocol met dubbele jodixanoldichtheidsgradiënt is de universele methode omdat het van toepassing is op alle AAV-mutante varianten, ongeacht hun receptorspecificiteit. Vroege methoden van AAV-zuivering waren gebaseerd op deeltjesdichtheid en omvatten isopycnische centrifugatie in CsCl en continue sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie19. Later werden serotype-specifieke benaderingen ontwikkeld, die gebruik maakten van monoklonale antilichamen gebonden aan Sepharose-kolommen20. In 1999 werd een nieuwe, op dichtheid gebaseerde zuiveringsmethode ontwikkeld met behulp van een discontinue jodixanolgradiënt en leverde AAV-isolaten op met een hogere infectiviteit dan die geïsoleerd uit CsCl-gradiënten21. Methoden om AAV te zuiveren werden verder ontwikkeld tot in het begin van de jaren 2000, aangezien sommige groepen hoogwaardige vloeistofchromatografie gebruikten om rAAV te zuiveren met een terugwinning van ruw lysaat van meer dan 70%22,23,24. Deze methoden worden nog steeds gebruikt in grootschalige productieprocessen25. Ondanks de ontwikkeling van chromatografiemethoden voor het isoleren van AAV, wordt zuivering door middel van jodixanoldichtheidsgradiëntcentrifugatie nog steeds veel gebruikt vanwege de lagere kosten en het serotype-agnosticisme26,27.
Hoewel deze methode zeer geschikt is voor de tijdbesparende preklinische productie van rAAV, is deze zeer beperkt in schaalbaarheid en kan deze worden aangepast voor cGMP-productie25. Zoals hierboven beschreven, hebben andere zuiveringsmethoden dus de voorkeur voor grootschalige productie. Bovendien is de transgene capaciteit van rAAV-vectoren beperkt. De maximale grootte voor een AAV-genoom dat intact kan worden verpakt, blijkt ongeveer 5,2 kb te zijn, voor een maximale transgengrootte van 4,9 kb, goed voor ITR's6. Dit bemoeilijkt de expressie van eiwitten waarvan het cDNA deze capaciteit overschrijdt. Deze eiwitten kunnen niet tot expressie worden gebracht door het hier beschreven systeem zonder modificatie van het transgen zelf of het gebruik van een gesplitst vectorsysteem. Chamberlain et al. beschrijven verschillende methoden om transgenen groter dan 4,9 kb tot expressie tebrengen28.
Deze methode is met name nuttig voor de productie van zeer complexe combinatorische capsidebibliotheken die AAV-capsiden bevatten met verschillende biochemische eigenschappen als gevolg van mutaties op het capside-oppervlak. Als het rAAV-preparaat bestemd is voor injectie bij dieren, vooral bij niet-menselijke primaten, is het van cruciaal belang om endotoxinebesmetting te beperken. Er moet grote zorg worden besteed aan het scheiden van gebieden die worden gebruikt om bacterieculturen te kweken van rAAV-productie om bacteriële besmetting tijdens alle stappen te voorkomen. Voer alle werkzaamheden uit met menselijke cellen en ruwe AAV in een bioveiligheidskast met behulp van wegwerpplastic. Dit voorkomt bacteriële besmetting en is een noodzaak voor het werken met AAV, aangezien het een BSL1-middel is.
Als een laboratorium geen toegang heeft tot een CO2 - incubator met een shaker, kan hechtende celkweek met HEK293-cellen worden gebruikt in plaats van Expi293-suspensiecelcultuur. Volg de instructies van de fabrikant voor subculturing en gebruik het transfectieprotocol beschreven in Crosson et al., 201817.
Cruciale stappen in dit protocol zijn Expi293-transfectie, bereiding van de jodixanolgradiënt en aspiratie van de jodixanolfractie die AAV bevat. Fouten tijdens een van deze stappen kunnen leiden tot suboptimale rAAV-opbrengsten of het niet produceren van rAAV.
Transfectie van de Expi293-cellen is een cruciale stap in de productie van rAAV met behulp van dit protocol. Op de dag van transfectie worden cellen geresuspendeerd in een half volume verse media om ze te voorzien van de voedingsstoffen die nodig zijn om te herstellen van transfectie29; Transfectie is een zeer belastend proces voor de cellen. De geconditioneerde media worden echter niet volledig weggegooid omdat ze groeifactoren en andere metabolieten bevatten die belangrijk zijn voor celonderhoud en groei. Het is van cruciaal belang dat PEI en DNA tien minuten lang incuberen voordat ze op cellen worden aangebracht om een geladen complex te vormen30. Zonder een complex met PEI te vormen, zal DNA niet efficiënt door cellen worden opgenomen.
Bij het produceren van rAAV hangt het aandeel van het virus dat in de media wordt aangetroffen af van de interacties van het specifieke serotype met Expi293-celreceptoren. Sommige serotypen worden sneller in celmedia vrijgegeven dan andere31, waardoor virale deeltjes uit celmedia moeten worden neergeslagen om de hoogst mogelijke opbrengst te vangen en het verlies van varianten te voorkomen op basis van een gebrek aan affiniteit voor Expi293-celreceptoren. Daarentegen heeft het serotype AAV2 sterke receptorinteracties met heparansulfaatproteoglycanen die aanwezig zijn in 293 cellen, dus er wordt zeer weinig verpakt virus gevonden in de media32. Wanneer u een derivaat van AAV2 produceert, laat u de PEG-neerslagstap weg. Voor de productie van combinatorische capsidebibliotheken of rAAV van alternatieve serotypen is precipitatie van virale deeltjes met PEG geschikt.
Het is van cruciaal belang dat 1 M natriumchloride aanwezig is in de 15% jodixanolfractie om geaggregeerde AAV-deeltjes te dissociëren tijdens ultracentrifugatie. Het weglaten van NaCl in deze fractie kan leiden tot ongewenste resultaten, zoals afname van de transductie-efficiëntie en immunogeniciteit33. Wees ten slotte zeer voorzichtig bij het opzuigen van AAV uit de jodixanolgradiënt. Het opzuigen van te veel van de jodixanolfractie kan leiden tot de aanwezigheid van lege capsiden in het eindproduct17.
Deze methode kan worden gebruikt om rAAV combinatorische capsidebibliotheken te verpakken voor gebruik in stroomafwaarts gerichte evolutie-experimenten om capsiden met een hoger tropisme voor bepaalde menselijke celtypen te identificeren. rAAV is stabiel bij 4 °C voor kortstondig gebruik en bij -70 °C voor langdurige opslag34. Momenteel wordt de recombinante AAV gebruikt in vijf door de FDA goedgekeurde medicijnen voor de behandeling van aandoeningen, waaronder Duchenne spierdystrofie 35,36,37. Er zijn verschillende aanvullende rAAV-therapieën in klinische en preklinische onderzoeken 38,39,40. Verder onderzoek naar deze vector is dus van cruciaal belang voor de ontwikkeling van aanvullende gentherapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen te melden.
Acknowledgments
Geen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
- Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
- Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration. BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).
- George, L. A., et al. Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A. N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy. Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. cD.
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).
- Zolotukhin, S. Production of recombinant adeno-associated virus vectors. Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).
- Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N., Ayuso, E. Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production. Mol Ther - Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).
- Costa-Verdera, H., et al. Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).
- Ertl, H. C. J. Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression. Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).
- Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
- Marsic, D., et al. Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants. Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).
- Grimm, D., Zolotukhin, S. E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution. Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).
- Biswas, M., et al. Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity. Mol Ther - Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).
- Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).
- Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation. Mol Ther - Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).
- Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting. Viruses. 15 (11), 2168 (2023).
- Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis. Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
- Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Debelak, D., et al. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2. J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).
- Burova, E., Ioffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
- Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).
- Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids. Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).
- Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein. BMC Biotechnol. 23 (1), 7 (2023).
- Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability. Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
- Wright, J. F., et al. Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation. Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).
- Gruntman, A. M., et al. Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).
- Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
- Mullard, A. FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections. Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).
- Center for Biologics Evaluation and Research. Approved Cellular and Gene Therapy Products. US Food Drug Adm. , (2023).
- Kang, L., et al. AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges. J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).
- De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Hemophilia gene therapy: The end of the beginning. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).
- Simons, E. J., Trapani, I. The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).
