Summary
Le virus adéno-associé est produit en culture cellulaire en suspension et purifié par centrifugation à double gradient de densité d’iodixanol. Des étapes sont incluses pour augmenter le rendement total du virus, réduire le risque de précipitation du virus et concentrer davantage le produit viral final. Les titres finaux attendus atteignent 10à 12 particules virales/mL et conviennent à une utilisation préclinique in vivo .
Abstract
Ce protocole décrit la production et la purification de virus adéno-associés recombinants (rAAV) par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol, une méthode de purification de l’AAV indépendante du sérotype décrite pour la première fois en 1999. Les vecteurs rAAV sont largement utilisés dans les applications de thérapie génique pour délivrer des transgènes à divers types de cellules humaines. Dans ce travail, le virus recombinant est produit par transfection de cellules Expi293 en culture en suspension avec des plasmides codant pour les gènes auxiliaires du transgène, de la capside vectorielle et de l’adénoviral. La centrifugation par gradient de densité d’iodixanol purifie les particules AAV complètes en fonction de la densité des particules. De plus, trois étapes sont incluses dans cette méthodologie désormais omniprésente afin d’augmenter le rendement total du virus, de diminuer le risque de précipitation due aux protéines contaminantes et de concentrer davantage le produit viral final, respectivement : précipitation des particules virales à partir de milieux cellulaires à l’aide d’une solution de polyéthylène glycol (PEG) et de chlorure de sodium, introduction d’un deuxième cycle de centrifugation par gradient de densité d’iodixanol, et échange de tampon via un filtre centrifuge. En utilisant cette méthode, il est possible d’obtenir des titres constants de l’ordre de 10à 12 particules virales/mL d’une pureté exceptionnelle pour une utilisation in vivo .
Introduction
Les vecteurs viraux adéno-associés recombinants (rAAV) sont des outils largement utilisés pour le traitement des maladies génétiques, notamment l’amyotrophie spinale, la dystrophie rétinienne et l’hémophilie A 1,2,3. Les vecteurs rAAV sont conçus pour ne pas contenir de gènes viraux présents dans l’AAV4 de type sauvage, un petit virus icosaédrique sans enveloppe avec un génome linéaire monocaténaire de 4,7 kb. L’AAV a été découvert pour la première fois dans les années 1960 en tant que contaminant des préparations d’adénovirus5. Malgré sa petite taille de capside, qui limite la taille du transgène pouvant être emballé à un maximum de 4,9 kb hors RTI6, l’AAV est utile pour l’administration de transgènes car il est non pathogène chez l’homme, permet l’expression du transgène dans de nombreux types de cellules divisées et non divisées et a des effets immunogènes limités7.
En tant que membres du genre dependoparvovirus, la production de rAAV repose sur l’expression de gènes auxiliaires présents dans l’adénovirus ou le virus de l’herpès simplex8. Plusieurs stratégies de production de rAAV ont été développées, mais la production dans les cellules HEK293 transformées avec les gènes auxiliaires adénoviraux E1A/E1B est la méthode la plus établie utilisée aujourd’hui9. L’approche générale de la production de rAAV commence par la transfection de cellules HEK293 avec trois plasmides contenant le transgène dans des répétitions terminales inversées (ITR), des gènes AAV rep et cap , et des gènes adénoviraux auxiliaires supplémentaires, respectivement. Soixante-douze heures après la transfection, les cellules sont récoltées et traitées pour purifier le rAAV contenant le transgène.
Dans le développement de nouveaux vecteurs rAAV à des fins thérapeutiques, l’un des principaux objectifs est de produire des vecteurs avec une efficacité de transduction accrue. Une augmentation de l’efficacité de transduction des cellules cibles signifierait une diminution de la dose clinique nécessaire de rAAV, diminuant ainsi la probabilité d’effets immunogènes indésirables allant de la neutralisation médiée par les anticorps aux toxicités aiguës10,11. Pour améliorer l’efficacité de la transduction des vecteurs rAAV, des modifications peuvent être apportées au génome emballé ou à la capside. Les méthodes viables pour ajuster l’efficacité de la transduction via la conception de génomes emballés comprennent l’incorporation de promoteurs forts et spécifiques aux tissus, la sélection réfléchie des éléments de traitement de l’ARNm et l’optimisation de la séquence codante pour améliorer l’efficacité de la traduction12. Les modifications de la capside sont effectuées dans le but d’augmenter le tropisme pour les types de cellules humaines cibles. Les efforts visant à développer de nouvelles capsides vectorielles de livraison de transgènes rAAV sont généralement caractérisés par une focalisation sur la conception rationnelle de capsides AAV avec des mutations spécifiques ciblant des récepteurs cellulaires spécifiques ou sur l’évolution dirigée pour identifier des capsides avec tropisme pour des types cellulaires spécifiques à partir de bibliothèques de capsides combinatoires de haute complexité sans cibler un récepteur spécifique (bien que certains groupes combinent ces approches)13, 14,15. Dans l’approche d’évolution dirigée, les banques de capsides combinatoires sont construites à l’aide d’un squelette de sérotype particulier avec des régions variables mutées sur la capside extérieure16. Les banques de capsides combinatoires sont souvent construites à partir de sérotypes AAV non originaires de l’homme, ce qui diminue le risque d’immunité préexistante lors de l’utilisation clinique10. Par conséquent, les méthodes de purification qui peuvent être appliquées à n’importe quel sérotype sont idéales pour éliminer le besoin d’optimisation spécifique au sérotype pour les sérotypes les moins couramment utilisés servant de squelette à ces bibliothèques.
La centrifugation par gradient de densité d’iodixanol est utilisée pour purifier des titres élevés de rAAV à forte infectiosité17. Dans ce protocole, le rAAV est produit en culture cellulaire en suspension pour réduire la quantité de travail nécessaire pour produire de gros titres d’AAV. Une étape de centrifugation est également incluse pour éliminer le lysat cellulaire afin de réduire la présence de protéines contaminantes et de diminuer le risque de précipitation virale. Ce protocole est une méthode rentable pour produire des préparations de rAAV de haute pureté adaptées à un usage préclinique.
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Protocol
La composition des solutions et des tampons utilisés dans ce protocole est fournie dans le tableau 1.
| Solution | Composition | |
| Tampon de lyse AAV | 1,2 mL de solution de NaCl 5 M | |
| 2 mL de solution de 1 M de Tris-HCl pH 8,5 | ||
| 80 μL de solution de 1 M de MgCl2 | ||
| mQ d’eau à 40 mL | ||
| Solution de précipitation AAV | 40 g de PEG 8000 | |
| 50 mL de solution de NaCl 5 M | ||
| mQ d’eau à 100 mL | ||
| 15 % de fraction d’iodixanol | 7,5 ml d’OptiPrep | |
| 3 ml de 10X DPBS | ||
| 6 mL de solution de NaCl 5 M | ||
| 30 μL de solution de 1 M MgCl2 | ||
| mQ à 30 mL | ||
| 25 % de fraction d’iodixanol | 12. 5 ml d’OptiPrep | |
| 3 ml de 10X DPBS | ||
| 30 μL de solution de 1 M MgCl2 | ||
| 60 μL de solution de rouge de phénol | ||
| mQ à 30 mL | ||
| Fraction d’iodixanol à 40 % | 33,3 ml d’OptiPrep | |
| 5 mL de 10X DPBS | ||
| 50 μL de solution de 1 M de MgCl2 | ||
| mQ à 50 mL | ||
| Fraction d’iodixanol à 60 % | 50 ml d’OptiPrep | |
| 100 μL de solution de rouge de phénol | ||
| Solution tampon AAV | 8 mL de NaCl 5 M | |
| 20 μL de F-68 Pluronic à 10 % | ||
| PBS à 200 mL | ||
Tableau 1 : Compositions des solutions utilisées dans ce protocole.
1. Triple transfection des cellules Expi293
- Amorcer les cellules Expi293 (voir le tableau des matières) à une densité initiale de 5 x 105 cellules viables (vc)/mL.
- Laisser les cellules incuber à 37 °C avec 8 % de CO2 et une vitesse d’agitation de 125 tr/min jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité de 3-5 x 106 vc/mL. Surveillez la densité et la viabilité des cellules à l’aide de l’exclusion au bleu trypan avec un compteur de cellules automatisé (voir le tableau des matériaux).
- Lorsque les cellules atteignent la densité cellulaire souhaitée, divisez-les de 1 à 10 en ajoutant des milieux frais afin que leur volume total soit dix fois supérieur à leur volume d’origine. Si nécessaire, transférez les cellules dans une fiole plus grande. Retournez à l’incubation.
- Continuer à dilater les cellules comme décrit aux étapes 1.2 et 1.3 jusqu’à ce qu’elles atteignent une densité d’au moins 2 x 106 vc/mL dans 250 mL de milieu dans une fiole de 1 L.
- La veille de la transfection, diluer les cellules à 2 x 106 vc/mL dans 250 mL de milieu, en jetant les cellules excédentaires si nécessaire. Incuber les cellules pendant la nuit.
- Le jour de la transfection, centrifuger la moitié des cellules à 58 x g pendant 5 min à 18 °C. Remettre la pastille en suspension dans le même volume (125 ml) de milieu frais. La viabilité cellulaire doit être proche de 98 %.
- Préparez deux tubes coniques de 50 ml. Étiquetez l’un « PEI » et l’autre « ADN ».
- Dans le tube conique étiqueté PEI, diluer 1,2 mL de PEI (Polyéthylénicimine, voir Tableau des matériaux) jusqu’à un volume total de 12,5 mL dans un milieu OptiMEM.
- Dans le tube conique marqué ADN, préparer une solution équimolaire d’ADN plasmidique à un total de 500 μg d’ADN dans un volume total de 12,5 mL dans un milieu OptiMEM.
- Ajouter la solution d’ADN à la solution PEI, retourner plusieurs fois pour bien combiner et laisser incuber à température ambiante pendant 10 min.
REMARQUE : Il est essentiel que la solution ADN-PEI soit autorisée à incuber pendant 10 minutes complètes pour que PEI forme des complexes chargés avec l’ADN. - Après l’incubation de la solution d’ADN-PEI pendant 10 minutes, utiliser une pipette sérologique pour appliquer lentement la solution d’ADN-PEImax sur les cellules Expi293. Remettre les cellules transfectées dans l’incubateur et les laisser incuber pendant 72 h (figure 1).
Figure 1 : Cellules Expi293 exprimant la GFP deux jours après la transfection. Après transfection avec un plasmide contenant un gène de GFP, les cellules Expi293 expriment transitoirement l’eGFP. La morphologie cellulaire est ronde. L’image a été capturée avec un temps d’exposition de 15 ms. Les images du microscope sont acquises à l’aide d’un microscope inversé équipé d’un éclairage par épifluorescence et d’un objectif 10x/0,30. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Purification du vecteur rAAV
- Après 72 h, transférer les cellules en suspension dans deux tubes coniques de 250 mL et les faire tourner à 415 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Verser le milieu surnageant dans un tube conique frais de 500 mL et conserver à 0 °C sur de la glace pour un traitement ultérieur.
- Remettre en suspension chaque pastille cellulaire dans 10 mL de tampon de lyse AAV (tableau 1). Mettez les deux lysats en commun dans l’un des tubes. Rincez l’autre tube avec 5 ml supplémentaires de tampon de lyse AAV, puis ajoutez-le aux lysats mélangés. Congelez à -70 °C.
REMARQUE : L’expérience peut être interrompue à ce stade. Conserver le milieu surnageant à -70 °C plutôt que sur de la glace. - Ajouter un volume de 1:4 de solution de précipitation AAV au milieu surnageant de l’étape 2.2. Retourner plusieurs fois pour bien mélanger et incuber à 0 °C sur de la glace pendant au moins 2 h ou toute la nuit.
- Centrifuger la solution incubée à 3000 x g pendant 1 h à 4 °C.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension le précipité viral contenant la pastille dans 5 mL de tampon de lyse AAV.
- Décongeler le lysat cellulaire à 37 °C au bain-marie.
- Mettez en commun le précipité viral avec le lysat cellulaire. C’est le lysat brut. Rincer le tube de centrifugation qui contenait le précipité viral avec 5 mL supplémentaires de tampon de lyse AAV et mélanger avec le lysat brut.
- Congeler le lysat brut à -70 °C, puis décongeler à 37 °C. Répétez ce cycle une fois de plus.
REMARQUE : Le lysat brut ne doit pas être laissé à 37 °C plus longtemps que nécessaire pour le décongeler. - Une fois décongelé pour la troisième fois, ajouter immédiatement 4 μL de benzonase au lysat brut, retourner pour mélanger et incuber pendant 30 min à 37 °C.
- Centrifuger le lysat brut pendant 10 min à 650 x g à 18 °C.
- Transférer le surnageant dans un tube conique propre de 50 mL. C’est le virus brut. Jeter la pastille.
- Centrifuger le virus brut pendant 30 minutes supplémentaires à 3000 x g à 18 °C pour éliminer les protéines contaminantes.
- Transférer le surnageant dans un tube conique propre de 50 mL. C’est le virus clarifié.
REMARQUE : L’expérience peut être interrompue à ce stade. Congelez le virus clarifié à -70 °C. - Configurez la pompe péristaltique multicanaux avec quatre tubes péristaltiques (voir tableau des matériaux). Fixez des capillaires aux deux extrémités de chaque tube.
- Placez les capillaires du côté entrée de la pompe dans un bécher rempli d’eau déminéralisée. Placez les capillaires du côté sortie de la pompe dans un bécher vide. Faites fonctionner la pompe péristaltique à 25,0 tr/min pour rincer le tube avec de l’eau déminéralisée (DI).
- Une fois rincé à fond, videz la tubulure péristaltique en faisant fonctionner la pompe jusqu’à ce que la tubulure soit remplie uniquement d’air. Posez tous les capillaires sur une lingette propre et non pelucheuse.
- Placez quatre tubes d’ultracentrifugation dans un rack du côté de sortie de la pompe.
- À l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL, versez soigneusement 10 mL de virus clarifié dans chaque tube d’ultracentrifugation. Veillez à ne pas introduire de bulles d’air.
REMARQUE : Le volume de virus clarifié dans chaque tube peut être étiré jusqu’à 12 mL par tube, si nécessaire. Réduire la quantité d’iodixanol à 60 % de manière appropriée à l’étape 2.25 ci-dessous. - Le virus clarifié est recouvert de fractions d’iodixanol (tableau 1) de la densité la plus faible à la densité la plus élevée à l’aide de la pompe péristaltique. La fraction de 15 % est ajoutée en premier, suivie de la fraction de 25 %, de la fraction de 40 % et enfin de la fraction de 60 %. Transférer 22 mL (5,5 mL par tube d’ultracentrifugation) de la fraction d’iodixanol à 15 % dans un tube conique propre de 50 mL. Placez les capillaires du côté entrée de la pompe dans le tube, en veillant à ce que tous les capillaires touchent le fond du tube.
- Démarrez la pompe et laissez le tube se remplir avec la fraction iodixanol. Lorsque la fraction d’iodixanol atteint les extrémités des capillaires du côté de sortie de la pompe, arrêtez la pompe.
- Insérez un capillaire de sortie dans chaque tube d’ultracentrifugation avec un virus clarifié, en veillant à ce que les capillaires touchent le fond de chaque tube d’ultracentrifugation.
REMARQUE : Il est d’une importance cruciale qu’il n’y ait plus d’air dans les capillaires. L’iodixanol peut s’écouler à travers la tubulure péristaltique à des vitesses légèrement différentes, alors assurez-vous que chaque capillaire de sortie individuel est complètement rempli d’iodixanol avant de l’insérer dans le virus clarifié. Il peut être nécessaire d’arrêter et de démarrer la pompe plusieurs fois. - Démarrez la pompe et laissez les tubes de l’ultracentrifugeuse se remplir. Lorsque la dernière fraction de 15 % est sur le point d’être acheminée dans les capillaires d’entrée, arrêtez la pompe. Il est essentiel qu’aucune bulle d’air ne pénètre dans le tube péristaltique.
REMARQUE : Si des bulles d’air pénètrent dans les capillaires d’entrée, la pompe peut être brièvement exécutée dans le sens inverse pour les repousser. - Transférer 22 mL (5,5 mL par tube d’ultracentrifugation) de la fraction d’iodixanol à 25 % dans le tube conique de 50 mL. Veillez à ce que tous les capillaires touchent le fond du tube et démarrez la pompe. Lorsque la dernière fraction de 25 % est sur le point d’être acheminée dans les capillaires d’entrée, arrêtez la pompe.
- Répéter l’étape 2.24 avec 20 mL (5 mL par tube d’ultracentrifugation) de la fraction d’iodixanol à 40 %, puis avec 24 mL (6 mL par tube d’ultracentrifugation) de la fraction à 60 %.
- S’il reste encore du volume non rempli dans le tube d’ultracentrifugation, continuez à ajouter plus de fraction à 60 % jusqu’à ce que les tubes d’ultracentrifugation soient complètement remplis de liquide.
- Remplissez chaque tube jusqu’à ce que le lysat forme un dôme sur le dessus mais ne déborde pas du tube. Arrêtez la pompe et retirez soigneusement chaque capillaire de sortie, en prenant soin de ne pas perturber le gradient d’iodixanol.
- Boucher chaque tube d’ultracentrifugation avec une entretoise et le charger dans un rotor de type 70 Ti (voir tableau des matériaux).
REMARQUE : Assurez-vous que le rotor est correctement équilibré. N’essayez pas d’utiliser l’ultracentrifugeuse sans formation appropriée. - Chargez le rotor Type 70 Ti dans l’ultracentrifugeuse et centrifugez-le à 489 000 x g pendant 1 h à 18 °C.
- Après centrifugation, déchargez le rotor de l’ultracentrifugeuse. Utilisez une pince à bec effilé pour retirer soigneusement chaque tube d’ultracentrifugation du rotor, en prenant soin de ne pas perturber le gradient d’iodixanol.
- Utilisez un support d’anneau de support avec pince pour fixer un tube d’ultracentrifugation.
- Fixez une aiguille de calibre 20 à une seringue de 5 ml et réservez. Utilisez une lingette non pelucheuse pour retirer le capuchon du tube de l’ultracentrifugeuse.
- Pénétrer la paroi du tube à ultracentrifuger avec l’aiguille à environ 3 mm sous l’interface iodixanol 40 %-60 % (Figure 2).
- Aspirez lentement l’interface et une partie de la fraction à 40 %. Évitez d’aspirer le haut de la fraction à 40 %, pour un tirage total d’environ 4 ml.
- En tenant un doigt sur le dessus ouvert du tube de l’ultracentrifugeuse, retirez la seringue et transférez la fraction AAV aspirée dans un tube conique de 50 ml. Jetez la seringue dans un récipient pour objets tranchants. Jetez le tube de l’ultracentrifugeuse.
- Répétez les étapes 2.31-2.35 pour chaque tube d’ultracentrifugation.
- Diluer la fraction AAV aspirée environ deux fois dans un tampon de lyse AAV jusqu’à un volume de 40 mL.
- Rincer la tubulure péristaltique comme décrit aux étapes 2.16-2.17.
REMARQUE : L’expérience peut être interrompue à ce stade. Conserver la fraction d’AAV diluée à 0 °C pendant la nuit. - Charger 20 mL de chacune des fractions AAV diluées dans deux nouveaux tubes d’ultracentrifugation.
- Pour le deuxième cycle de centrifugation par gradient de densité d’iodixanol, la fraction d’AAV diluée est sous-jacente comme décrit ci-dessus en utilisant seulement 10 mL (5 mL par tube d’ultracentrifugation) de la fraction à 40 % et 14 mL (7 mL par tube d’ultracentrifugation) de la fraction à 60 %. Répéter les étapes 2.29 à 2.36 pour l’ultracentrifugation et l’aspiration.
REMARQUE : Avant de ranger la pompe péristaltique et le tube, rincez le tube avec de l’eau DI comme décrit aux étapes 2.16-2.17.
Figure 2 : Gradient d’iodixanol avec une interface d’iodixanol marquée à 40 %-60 %. (A) Premier gradient d’iodixanol. Le rouge de phénol est utilisé dans les fractions d’iodixanol à 40 % et d’iodixanol à 60 %. Il apparaît comme une couleur différente en raison de la différence de pH entre les deux fractions. La flèche indique l’endroit où la seringue doit être insérée pour récolter la fraction rAAV, juste en dessous de l’interface iodixanol 40 % -60 %. (B) Deuxième gradient d’iodixanol. Seules les fractions d’iodixanol à 40 % et 60 % sont utilisées dans cette étape. La flèche indique où la seringue doit être insérée pour récolter la fraction rAAV. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Échange de tampon et concentration de virus
- Après avoir obtenu la fraction AAV du deuxième cycle de centrifugation par gradient de densité d’iodixanol, diluez-la deux fois avec une solution tampon AAV.
- Équilibrer le filtre centrifuge en ajoutant 20 mL de solution tampon AAV sur le dessus du filtre. Centrifuger l’appareil à 3000 x g à 18 °C pendant 5 min et jeter le flux.
- Ajouter la fraction AAV diluée au filtre centrifuge. Centrifuger l’appareil à 3000 x g à 18 °C pendant 5 min et jeter le flux.
- Ajouter 20 mL de solution tampon AAV sur le dessus du filtre. Centrifuger l’appareil à 3000 x g à 18 °C pendant 5 min et jeter le flux.
REMARQUE : Si la membrane filtrante centrifuge est obstruée, ce qui entraîne un écoulement inefficace de la solution, utilisez soigneusement une micropipette P200 pour aspirer la solution de haut en bas dans le haut du filtre. Faites très attention à ne pas toucher le filtre avec la pointe de la micropipette. - Répétez l’étape 3.4 deux fois de plus.
REMARQUE : Assurez-vous que l’AAV n’est pas trop concentré en maintenant au moins 1 mL de volume dans la partie supérieure du filtre. Il peut être nécessaire d’ajuster les temps de centrifugation pour éviter une surconcentration. Si l’AAV est trop concentré, des précipitations peuvent se produire. - Pour un titre final de l’ordre de 10à 12 vg/mL, réduire le virus jusqu’à un volume final d’environ 1 mL.
REMARQUE : Selon le squelette de sérotype utilisé et l’efficacité de l’emballage du virus, vous devrez peut-être concentrer le virus dans un volume plus petit. - Utilisez une micropipette p1000 pour transférer l’AAV concentré du haut du filtre centrifuge dans un tube de microcentrifugation. À l’aide d’une micropipette p200, laver le filtre centrifuge avec 50 μL de tampon AAV pour recueillir tout virus restant et s’accumuler avec le reste de l’AAV concentré.
- Réserver une aliquote de 2 μL de l’AAV concentré pour le titrage. Voir le tableau supplémentaire 1 pour voir les amorces ITR qui peuvent être utilisées pour la qPCR.
- Passez l’AAV concentré à travers un filtre à seringue de 0,2 μm pour le stériliser.
REMARQUE : Lors de la stérilisation d’un petit volume, veillez à sélectionner un filtre de seringue de petit diamètre afin de minimiser la perte de virus. L’utilisation d’un filtre à faible liaison protéique de petit diamètre entraînera une perte virale minimale (données non présentées). - L’AAV stérilisé peut être utilisé immédiatement pour transduire les cellules ou stocké à 4 °C pour une utilisation dans les quatre semaines. Il doit être conservé à -70 °C pour un stockage à plus long terme.
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Representative Results
Cette méthode peut être utilisée pour obtenir des titres d’au moins 10à 12 particules virales par ml. Un titre peut être obtenu (Figure 3) par qPCR à l’aide des amorces ITR fournies dans le tableau supplémentaire 1, par ddPCR ou par toute autre méthode de titrage. Des titres sous-optimaux pourraient résulter de l’utilisation d’un gène cap codant pour une capside avec une faible efficacité d’emballage.
Une autre source possible de résultats sous-optimaux est la faible efficacité de transduction des cellules Expi293. Il est recommandé d’avoir des cellules à une densité de 3-4 x 106 vc/mL le jour de la transfection et que la viabilité cellulaire soit proche de 98%. Dans la présente étude, les auteurs ont obtenu un titre de 1,07 x 1012 vg en suivant ce protocole. Ce rendement s’aligne sur les rendements précédents obtenus à partir de l’emballage AAVrh7418.
Figure 3 : Détermination du titre par qPCR. La courbe 1 a été générée avec une concentration standard de 3,66 x 1011 vg/mL, la courbe 2 a été générée avec une concentration standard de 3,66 x 1010 vg/mL, la courbe 3 était l’échantillon final concentré d’AAV, la courbe 4 a été générée avec une concentration standard de 3,66 x 109 vg/mL et la courbe 5 a été générée avec une concentration standard de 3,66 x 108 vg/mL. Chaque réaction qPCR a été réalisée en double. (A) Courbe d’amplification qPCR. Les étalons ont été générés par dilution en série d’un étalon AAV titré par ddPCR. La concentration de l’étalon non dilué était de 3,66 x 1012 vg/mL. (B) Courbe standard générée par qPCR. Il a été déterminé que l’AAV produit avait une concentration de 1,85 x 1011 vg/mL dans 5,75 mL, pour un rendement total de 1,07 x 1012 vg. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau supplémentaire 1 : Séquences d’amorces directes et inverses pour les répétitions terminales inversées (ITR) AAV. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le protocole de purification à double gradient de densité d’iodixanol est la méthode universelle car il est applicable à tous les variants mutants AAV, quelle que soit leur spécificité de récepteur. Les premières méthodes de purification des AAV reposaient sur la densité des particules et comprenaient la centrifugation isopycnique dans le CsCl et la centrifugation continue par gradient de densité du saccharose19. Plus tard, des approches spécifiques au sérotype ont été développées, qui ont utilisé des anticorps monoclonaux liés aux colonnes de sépharose20. Une nouvelle méthode de purification basée sur la densité utilisant un gradient discontinu d’iodixanol a été mise au point en 1999 et a donné des isolats AAV avec une infectiosité plus élevée que ceux isolés des gradients CsCl21. Les méthodes de purification de l’AAV ont continué à être développées jusqu’au début des années 2000, car certains groupes utilisaient la chromatographie liquide à haute performance pour purifier le rAAV avec une récupération du lysat brut supérieure à 70 %22,23,24. Ces méthodes sont encore utilisées dans les procédés de fabrication à grande échelle25. Malgré le développement de méthodes de chromatographie pour isoler l’AAV, la purification par centrifugation par gradient de densité d’iodixanol est encore largement utilisée en raison de son faible coût et de son agnosticisme sérotypique26,27.
Bien que cette méthode soit bien adaptée à la production préclinique rapide de rAAV, elle est très limitée dans son évolutivité et sa capacité à être adaptée à la fabrication cGMP25. Ainsi, comme décrit ci-dessus, d’autres méthodes de purification sont préférées pour la production à grande échelle. De plus, la capacité de transgène des vecteurs rAAV est limitée. La limite de taille pour un génome d’AAV pouvant être emballé intact s’est avérée être d’environ 5,2 kb, pour une taille maximale de transgène de 4,9 kb, en tenant compte des ITR6. Cela complique l’expression des protéines dont l’ADNc dépasse cette capacité. Ces protéines ne peuvent pas être exprimées par le système décrit ici sans modification du transgène lui-même ou sans l’utilisation d’un système de vecteurs divisés. Chamberlain et al. décrivent plusieurs méthodes pour exprimer des transgènes supérieurs à 4,9 kb28.
Cette méthode est particulièrement utile pour la production de banques de capsides combinatoires de haute complexité contenant des capsides AAV aux propriétés biochimiques variées dues aux mutations présentes à la surface de la capside. Si la préparation rAAV est destinée à l’injection chez les animaux, en particulier chez les primates non humains, il est essentiel de limiter la contamination par les endotoxines. Il faut prendre grand soin de séparer les zones utilisées pour cultiver les cultures bactériennes de la production de rAAV afin d’éviter la contamination bactérienne à toutes les étapes. Effectuez tous les travaux avec des cellules humaines et des AAV bruts dans une enceinte de biosécurité à l’aide d’ustensiles en plastique jetables. Cela permet d’éviter la contamination bactérienne et est une nécessité pour travailler avec l’AAV, car il s’agit d’un agent BSL1.
Si un laboratoire n’a pas accès à un incubateur de CO2 avec agitateur, une culture cellulaire adhérente avec des cellules HEK293 peut être utilisée à la place de la culture cellulaire en suspension Expi293. Suivez les instructions du fabricant pour la sous-culture et utilisez le protocole de transfection décrit dans Crosson et coll., 201817.
Les étapes critiques de ce protocole sont la transfection d’Expi293, la préparation du gradient d’iodixanol et l’aspiration de la fraction d’iodixanol contenant de l’AAV. Des erreurs au cours de l’une de ces étapes peuvent entraîner des rendements rAAV sous-optimaux ou un échec de la production de rAAV.
La transfection des cellules Expi293 est une étape critique dans la production de rAAV à l’aide de ce protocole. Le jour de la transfection, les cellules sont remises en suspension dans un demi-volume de milieu frais pour leur fournir les nutriments nécessaires à la récupération de la transfection29 ; La transfection est un processus très éprouvant pour les cellules. Cependant, le milieu conditionné n’est pas entièrement éliminé car il contient des facteurs de croissance et d’autres métabolites importants pour le maintien et la croissance des cellules. Il est essentiel que le PEI et l’ADN incubent pendant dix minutes complètes avant d’être appliqués sur les cellules afin de former un complexe chargé30. Sans formation d’un complexe avec l’IPE, l’ADN ne sera pas efficacement absorbé par les cellules.
Lors de la production de rAAV, la proportion de virus trouvée dans le milieu dépend des interactions du sérotype particulier avec les récepteurs cellulaires Expi293. Certains sérotypes sont libérés dans les milieux cellulaires à des taux plus élevés que d’autres31, ce qui nécessite que les particules virales soient précipitées à partir des milieux cellulaires pour obtenir le rendement le plus élevé possible et prévenir la perte de tout variant en raison d’un manque d’affinité pour les récepteurs cellulaires Expi293. En revanche, le sérotype AAV2 a de fortes interactions réceptrices avec les protéoglycanes sulfate d’héparane présents dans 293 cellules, de sorte que très peu de virus emballés se trouvent dans le milieu32. Lors de la production d’un dérivé d’AAV2, omettez l’étape de précipitation PEG. Pour la production de banques de capsides combinatoires ou de rAAV de sérotypes alternatifs, la précipitation des particules virales avec le PEG est appropriée.
Il est essentiel que du chlorure de sodium 1 M soit présent dans la fraction d’iodixanol à 15 % pour dissocier les particules agrégées d’AAV pendant l’ultracentrifugation. L’omission de NaCl dans cette fraction peut entraîner des résultats indésirables, tels qu’une diminution de l’efficacité de la transduction et de l’immunogénicité33. Enfin, faites très attention à l’aspiration de l’AAV à partir du gradient d’iodixanol. L’aspiration d’une trop grande quantité de fraction iodixanol peut entraîner la présence de capsides vides dans le produit final17.
Cette méthode peut être utilisée pour conditionner des bibliothèques de capsides combinatoires rAAV à utiliser dans des expériences d’évolution dirigées en aval afin d’identifier les capsides avec un tropisme plus élevé pour certains types de cellules humaines. rAAV est stable à 4 °C pour une utilisation à court terme et à -70 °C pour un stockage à long terme34. Actuellement, l’AAV recombinant est utilisé dans cinq médicaments approuvés par la FDA pour traiter des affections, dont la dystrophie musculaire de Duchenne 35,36,37. Plusieurs autres thérapies rAAV font l’objet d’essais cliniques et précliniques 38,39,40. Des recherches supplémentaires sur ce vecteur sont donc essentielles au développement de thérapies géniques supplémentaires.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucune divulgation à signaler.
Acknowledgments
Aucun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
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