Summary
Adenoassocierat virus produceras i suspensionscellodling och renas genom dubbel jodixanolgradientcentrifugering. Åtgärder ingår för att öka det totala virusutbytet, minska risken för virusutfällning och ytterligare koncentrera den slutliga virusprodukten. Förväntade slutliga titrar når 1012 viruspartiklar/ml och är lämpliga för preklinisk in vivo-användning .
Abstract
Detta protokoll beskriver produktion och rening av rekombinant adenoassocierat virus (rAAV) genom jodixanolgradientcentrifugering, en serotypagnostisk metod för rening av AAV som först beskrevs 1999. rAAV-vektorer används ofta i genterapiapplikationer för att leverera transgener till olika mänskliga celltyper. I detta arbete produceras det rekombinanta viruset genom transfektion av Expi293-celler i suspensionsodling med plasmider som kodar för transgenen, vektorkapsiden och adenovirala hjälpargener. Iodixanol densitetsgradientcentrifugering renar fulla AAV-partiklar baserat på partikeldensitet. Dessutom ingår tre steg i denna nu allestädes närvarande metod för att öka det totala virusutbytet, minska risken för utfällning på grund av kontaminerande proteiner och ytterligare koncentrera den slutliga virusprodukten: utfällning av viruspartiklar från cellmedia med hjälp av en lösning av polyetylenglykol (PEG) och natriumklorid, införandet av en andra omgång av jodixanolgradientcentrifugering, och buffertutbyte via ett centrifugalfilter. Med hjälp av denna metod är det möjligt att konsekvent uppnå titrar i intervallet 1012 viruspartiklar/ml med exceptionell renhet för in vivo-användning .
Introduction
Rekombinanta adenoassocierade virala (rAAV) vektorer är allmänt använda verktyg för behandling av genetiska sjukdomar, inklusive spinal muskelatrofi, retinal dystrofi och hemofili A 1,2,3. rAAV-vektorer är konstruerade för att sakna virala gener som finns i vildtyp AAV4, ett litet, icke-hölje ikosaedriskt virus med ett linjärt enkelsträngat 4,7 kb DNA-genom. AAV upptäcktes först på 1960-talet som en förorening av adenoviruspreparat5. Trots sin lilla kapsidstorlek, som begränsar storleken på transgenen som kan förpackas till maximalt 4,9 kb exklusive ITR6, är AAV användbar för transgenleverans eftersom den är icke-patogen hos människor, tillåter uttryck av transgen i många delande och icke-delande celltyper och har begränsade immunogena effekter7.
Som medlemmar av släktet dependoparvovirus är produktionen av rAAVs beroende av uttrycket av hjälpgener som finns i adenovirus eller herpes simplexvirus8. Flera strategier för att producera rAAV har utvecklats, men produktion i HEK293-celler transformerade med adenovirala E1A/E1B-hjälpargener är den mest etablerade metoden som används idag9. Det allmänna tillvägagångssättet för rAAV-produktion börjar med transfektionen av HEK293-celler med tre plasmider som innehåller transgenen inom inverterade terminalupprepningar (ITR), AAV-rep - och cap-gener respektive ytterligare adenovirala hjälpgener. Sjuttiotvå timmar efter transfektionen skördas cellerna och bearbetas för att rena rAAV som innehåller transgenen.
I utvecklingen av nya rAAV-vektorer för terapeutiska ändamål är ett viktigt mål att producera vektorer med ökad transduktionseffektivitet. En ökning av transduktionseffektiviteten hos målceller skulle innebära en minskning av den nödvändiga kliniska dosen av rAAV, vilket minskar sannolikheten för negativa immunogena effekter som sträcker sig från antikroppsmedierad neutralisering till akut toxicitet10,11. För att förbättra transduktionseffekten hos rAAV-vektorer kan förändringar göras i det förpackade genomet eller i kapsiden. Genomförbara metoder för att finjustera transduktionseffektiviteten via paketerad genomdesign inkluderar inkorporering av starka och vävnadsspecifika promotorer, genomtänkt urval av mRNA-bearbetningselement och kodningssekvensoptimering för att förbättra translationseffektiviteten12. Förändringar av kapsiden görs med målet att öka tropismen för mänskliga celltyper. Ansträngningar för att utveckla nya rAAV-transgenleveransvektorkapsider kännetecknas i allmänhet av ett fokus på antingen rationell design av AAV-kapsider med specifika mutationer riktade mot specifika cellreceptorer eller riktad evolution för att identifiera kapsider med tropism för specifika celltyper från kombinatoriska kapsidbibliotek med hög komplexitet utan att rikta in sig på en specifik receptor (även om vissa grupper kombinerar dessa tillvägagångssätt)13, 14,15. I den riktade evolutionsmetoden konstrueras kombinatoriska kapsidbibliotek med hjälp av en särskild serotypryggrad med muterade variabla regioner på kapsidens utsida16. Kombinatoriska kapsidbibliotek är ofta konstruerade av AAV-serotyper som inte har sitt ursprung hos människor, vilket minskar risken för redan existerande immunitet vid klinisk användning10. Därför är reningsmetoder som kan tillämpas på alla serotyper idealiska för att eliminera behovet av serotypspecifik optimering för de mindre vanliga serotyperna som fungerar som ryggrad för dessa bibliotek.
Iodixanol densitetsgradientcentrifugering används för att rena höga titrar av rAAV med hög infektionsförmåga17. I detta protokoll produceras rAAV i suspensionscellodling för att minska mängden arbete som behövs för att producera stora titrar av AAV. Ett centrifugeringssteg ingår också för att rensa celllysat för att minska förekomsten av kontaminerande proteiner och minska risken för virusutfällning. Detta protokoll är en kostnadseffektiv metod för att producera preparat med rAAV med hög renhet som är lämpliga för preklinisk användning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sammansättningen av de lösningar och buffertar som används i detta protokoll anges i tabell 1.
| Lösning | Sammansättning | |
| AAV-lysbuffert | 1,2 ml 5 M NaCl-lösning | |
| 2 ml 1 M Tris-HCl pH 8,5-lösning | ||
| 80 μl 1 M MgCl2-lösning | ||
| mQ vatten till 40 ml | ||
| AAV-utfällningslösning | 40 g PEG 8000 | |
| 50 ml 5 M NaCl-lösning | ||
| mQ vatten till 100 ml | ||
| 15% jodixanolfraktion | 7,5 ml OptiPrep | |
| 3 ml 10X DPBS | ||
| 6 ml 5 M NaCl-lösning | ||
| 30 μl 1 M MgCl2-lösning | ||
| mQ till 30 ml | ||
| 25% jodixanolfraktion | 12. 5 ml OptiPrep | |
| 3 ml 10X DPBS | ||
| 30 μl 1 M MgCl2-lösning | ||
| 60 uL fenolröd lösning | ||
| mQ till 30 ml | ||
| 40% jodixanolfraktion | 33,3 ml OptiPrep | |
| 5 ml 10X DPBS | ||
| 50 μl 1 M MgCl2-lösning | ||
| mQ till 50 ml | ||
| 60% jodixanolfraktion | 50 ml OptiPrep | |
| 100 μl fenolröd lösning | ||
| AAV-buffertlösning | 8 ml 5 M NaCl | |
| 20 uL av 10% Pluronic F-68 | ||
| PBS till 200 ml | ||
Tabell 1: Lösningssammansättningar för lösningar som används i detta protokoll.
1. Trippeltransfektion av Expi293-celler
- Frö Expi293-celler (se materialtabell) med en initial densitet av 5 x 105 livskraftiga celler (vc)/ml.
- Låt cellerna inkubera vid 37 °C med 8 % CO2 och en skakhastighet på 125 rpm tills de når en densitet av 3-5 x 106 vc/ml. Övervaka celldensitet och viabilitet med hjälp av trypanblå uteslutning med en automatiserad cellräknare (se Materialförteckning).
- När cellerna når önskad celltäthet delar du dem 1 till 10 genom att tillsätta nya medier så att deras totala volym är tio gånger deras ursprungliga volym. Överför vid behov cellerna till en större kolv. Återgå till inkubation.
- Fortsätt att expandera cellerna enligt beskrivningen i steg 1.2–1.3 tills de når en densitet på minst 2 x 106 vc/ml i 250 ml medium i en 1 L kolv.
- Dagen före transfektionen, späd cellerna till 2 x 106 vc/ml i 250 ml media och kassera överflödiga celler vid behov. Inkubera cellerna över natten.
- På transfektionsdagen centrifugeras hälften av cellerna vid 58 x g i 5 minuter vid 18 °C. Återsuspendera cellpelleten i samma volym (125 ml) färskt medium. Cellviabiliteten bör vara nära 98 %.
- Förbered två 50 ml koniska rör. Märk den ena med "PEI" och den andra med "DNA".
- I det koniska röret märkt PEI, späd 1.2 ml PEI (polyetylenimin, se materialtabell) till en total volym av 12.5 ml i OptiMEM-media.
- I det koniska röret märkt DNA, bered en ekvimolär lösning av plasmid-DNA till totalt 500 μg DNA i en total volym av 12,5 ml i OptiMEM-media.
- Tillsätt DNA-lösningen till PEI-lösningen, vänd upp och ner flera gånger för att kombinera ordentligt och låt inkubera i rumstemperatur i 10 minuter.
OBS: Det är viktigt att DNA-PEI-lösningen får inkubera i hela 10 minuter för att PEI ska kunna bilda laddade komplex med DNA. - Efter att DNA-PEI-lösningen har inkuberats i 10 minuter, använd en serologisk pipett för att långsamt applicera DNA-PEImax-lösningen på Expi293-cellerna. Lägg tillbaka de transfekterade cellerna i inkubatorn och låt dem inkubera i 72 timmar (figur 1).
Figur 1: Expi293-celler som uttrycker GFP två dagar efter transfektion. Efter transfektion med en plasmid som innehåller en gen för GFP uttrycker Expi293-cellerna tillfälligt eGFP. Cellmorfologin är rund. Bilden togs med en exponeringstid på 15 ms. Mikroskopbilder tas med hjälp av ett inverterat mikroskop utrustat med epi-fluorescensbelysning och ett 10x/0,30-objektiv. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. rening av rAAV-vektorer
- Efter 72 timmar överförs cellerna i suspension till två 250 ml koniska rör och centrifugeras med 415 x g i 10 minuter vid 4 °C.
- Häll supernatanten i ett nytt 500 ml koniskt rör och förvara vid 0 °C på is för senare bearbetning.
- Återsuspendera varje cellpellet i 10 ml AAV-lysbuffert (tabell 1). Slå samman de två lysaten i ett av rören. Skölj det andra röret med ytterligare 5 ml AAV-lyseringsbuffert och tillsätt det sedan till de poolade lysaten. Frys vid -70 °C.
OBS: Experimentet kan pausas vid denna tidpunkt. Förvara supernatanten vid -70 °C i stället för på is. - Tillsätt 1:4 volym AAV-utfällningslösning till supernatantmediet från steg 2.2. Vänd upp och ner flera gånger för att blanda ordentligt och inkubera vid 0 °C på is i minst 2 timmar eller över natten.
- Centrifugera den inkuberade lösningen vid 3000 x g i 1 timme vid 4 °C.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten som innehåller virusfällning i 5 ml AAV-lysbuffert.
- Tina celllysatet vid 37 °C i ett vattenbad.
- Slå samman virusfällningen med celllysatet. Detta är det råa lysatet. Skölj centrifugeringsröret som innehöll virusfällningen med ytterligare 5 ml AAV-lysbuffert och poola med rålysatet.
- Frys rålysatet till -70 °C och tina sedan vid 37 °C. Upprepa denna cykel en gång till.
OBS: Rålysatet bör inte lämnas vid 37 °C längre än vad som är nödvändigt för att tina det. - När det har tinats upp för tredje gången, tillsätt omedelbart 4 μl bensonas till det råa lysatet, vänd upp och ner för att blanda och inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
- Centrifugera rålysatet i 10 minuter vid 650 x g vid 18 °C.
- Överför supernatanten till ett rent 50 ml koniskt rör. Detta är det råa viruset. Kassera pelleten.
- Centrifugera råviruset i ytterligare 30 minuter vid 3000 x g vid 18 °C för att avlägsna kontaminerande proteiner.
- Överför supernatanten till ett rent 50 ml koniskt rör. Detta är det klargjorda viruset.
OBS: Experimentet kan pausas vid denna tidpunkt. Frys ner det klarnade viruset till -70 °C. - Ställ in den flerkanaliga peristaltiska pumpen med fyra peristaltiska rör (se materialförteckning). Fäst kapillärerna i båda ändarna av varje rör.
- Placera kapillärerna på pumpens ingångssida i en bägare fylld med avjoniserat vatten. Placera kapillärerna på pumpens utloppssida i en tom bägare. Kör den peristaltiska pumpen på 25.0 rpm för att spola slangen med avjoniserat (DI) vatten.
- När den är noggrant spolad, töm den peristaltiska slangen genom att köra pumpen tills slangen endast är fylld med luft. Lägg alla kapillärer på en ren luddfri våtservett.
- Placera fyra ultracentrifugrör i ett ställ på pumpens utgångssida.
- Använd en 10 ml serologisk pipett för att försiktigt dispensera 10 ml klargjort virus i varje ultracentrifugrör. Var noga med att inte introducera luftbubblor.
OBS: Volymen av klargjort virus i varje rör kan sträckas till upp till 12 ml per rör, om det behövs. Minska mängden 60 % jodixanol på lämpligt sätt i steg 2.25 nedan. - Det klarifierade viruset beläggs med jodixanolfraktioner (tabell 1) från lägsta densitet till högsta densitet med hjälp av den peristaltiska pumpen. 15%-fraktionen tillsätts först, följt av 25%-fraktionen, 40%-fraktionen och slutligen 60%-fraktionen. Överför 22 ml (5,5 ml per ultracentrifugrör) av 15 % jodixanolfraktionen till ett rent 50 ml koniskt rör. Placera kapillärerna på pumpens ingångssida i röret och se till att alla kapillärer vidrör botten av röret.
- Starta pumpen och låt slangen fyllas med jodixanolfraktionen. När jodixanolfraktionen når ändarna av kapillärerna på pumpens utgångssida, stoppa pumpen.
- Sätt in en utgångskapillär i varje ultracentrifugrör med klargjort virus, se till att kapillärerna vidrör botten av varje ultracentrifugrör.
OBS: Det är av avgörande betydelse att det inte finns någon luft kvar i kapillärerna. Jodixanol kan flöda genom den peristaltiska slangen i något olika hastigheter, så se till att varje enskild utgående kapillär är helt fylld med jodixanol innan du sätter in den i det klargjorda viruset. Det kan vara nödvändigt att stoppa och starta pumpen flera gånger. - Starta pumpen och låt ultracentrifugrören fyllas. När den sista av 15 %-fraktionen är på väg att tas in i de ingående kapillärerna, stoppa pumpen. Det är viktigt att inga luftbubblor kommer in i den peristaltiska slangen.
OBS: Om luftbubblor kommer in i de ingående kapillärerna kan pumpen kort köras i motsatt riktning för att trycka ut dem igen. - Överför 22 ml (5,5 ml per ultracentrifugrör) av 25 % jodixanolfraktionen till det 50 ml koniska röret. Se till att alla kapillärer vidrör botten av slangen och starta pumpen. När det sista av 25%-fraktionen är på väg att tas in i ingångskapillärerna, stoppa pumpen.
- Upprepa steg 2.24 med 20 ml (5 ml per ultracentrifugrör) av 40 % jodixanolfraktionen och sedan med 24 ml (6 ml per ultracentrifugrör) av 60 %-fraktionen.
- Om det fortfarande finns ofylld volym kvar i ultracentrifugröret, fortsätt att tillsätta mer av 60 %-fraktionen tills ultracentrifugrören är helt fyllda med vätska.
- Fyll varje rör tills lysatet gör en kupol över toppen men inte svämmar över från röret. Stoppa pumpen och ta försiktigt bort varje utgående kapillär, var noga med att inte störa jodixanolgradienten.
- Täck varje ultracentrifugrör med en distans och ladda den i en typ 70 Ti-rotor (se materialförteckning).
OBS: Se till att rotorn är korrekt balanserad. Försök inte använda ultracentrifugen utan ordentlig utbildning. - Ladda rotorn av typ 70 Ti i ultracentrifugen och centrifugera vid 489 000 x g i 1 timme vid 18 °C.
- Efter centrifugering, lossa rotorn från ultracentrifugen. Använd en nåltång för att försiktigt ta bort varje ultracentrifugrör från rotorn, var noga med att inte störa jodixanolgradienten.
- Använd ett stödringsstativ med clamp för att säkra ett ultracentrifugrör.
- Fäst en 20 GA-nål på en 5 ml spruta och lägg åt sidan. Använd en luddfri våtservett för att ta bort locket från ultracentrifugröret.
- Penetrera ultracentrifugrörets vägg med nålen cirka 3 mm under 40%-60% jodixanolgränssnittet (figur 2).
- Aspirera långsamt gränssnittet och en del av 40%-fraktionen. Undvik att aspirera toppen av 40%-fraktionen, för ett totalt drag på cirka 4 ml.
- Håll ett finger över den öppna toppen av ultracentrifugröret, dra ut sprutan och överför den aspirerade AAV-fraktionen till ett 50 ml koniskt rör. Kassera sprutan i en behållare för vassa föremål. Kassera ultracentrifugröret.
- Upprepa steg 2.31-2.35 för varje ultracentrifugrör.
- Späd den aspirerade AAV-fraktionen ungefär två gånger i AAV-lysbuffert till en volym av 40 ml.
- Spola den peristaltiska slangen enligt beskrivningen i steg 2.16-2.17.
OBS: Experimentet kan pausas vid denna tidpunkt. Förvara den utspädda AAV-fraktionen vid 0 °C över natten. - Fyll på 20 ml vardera av den utspädda AAV-fraktionen i två nya ultracentrifugrör.
- För den andra omgången av gradientcentrifugering med jodxanoldensitet beläggs den utspädda AAV-fraktionen enligt beskrivningen ovan med endast 10 ml (5 ml per ultracentrifugrör) av 40-procentsfraktionen och 14 ml (7 ml per ultracentrifugrör) av 60-procentsfraktionen. Upprepa steg 2.29-2.36 för ultracentrifugering och aspiration.
OBS: Innan du förvarar den peristaltiska pumpen och slangen, spola ur slangen med DI-vatten enligt beskrivningen i steg 2.16-2.17.
Figur 2: Jodixanolgradient med 40%-60% jodixanolgränssnitt märkt. A) Första jodixanolgradienten. Fenolrött används i 40 % jodixanol- och 60 % jodixanolfraktioner. Det ser ut som en annan färg på grund av skillnaden i pH mellan de två fraktionerna. Pilen visar var sprutan ska sättas in för att skörda rAAV-fraktionen, strax under 40%-60% jodixanolgränssnittet. B) Andra jodixanolgradienten. Endast 40 % och 60 % jodixanolfraktioner används i detta steg. Pilen visar var sprutan ska sättas in för att skörda rAAV-fraktionen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Buffertutbyte och viruskoncentration
- Efter att ha erhållit AAV-fraktionen från den andra omgången av joddensitetsgradientcentrifugering, späd den tvåfaldigt med AAV-buffertlösning.
- Jämvikt centrifugalfiltret genom att tillsätta 20 ml AAV-buffertlösning till toppen av filtret. Centrifugera apparaten vid 3000 x g vid 18 °C i 5 minuter och kassera genomflödet.
- Tillsätt den utspädda AAV-fraktionen till centrifugalfiltret. Centrifugera apparaten vid 3000 x g vid 18 °C i 5 minuter och kassera genomflödet.
- Tillsätt 20 ml AAV-buffertlösning till toppen av filtret. Centrifugera apparaten vid 3000 x g vid 18 °C i 5 minuter och kassera genomflödet.
OBS: Om centrifugalfiltermembranet blockeras, vilket gör att lösningen rinner igenom ineffektivt, använd försiktigt en P200-mikropipett för att dra upp och ner lösningen i toppen av filtret. Var ytterst försiktig så att du inte vidrör filtret med mikropipettspetsen. - Upprepa steg 3.4 två gånger till.
OBS: Se till att AAV inte är överkoncentrerad genom att hålla minst 1 ml volym i toppen av filtret. Det kan vara nödvändigt att justera centrifugeringstiderna för att förhindra överkoncentration. Om AAV är överkoncentrerat kan nederbörd uppstå. - För en slutlig titer i intervallet 1012 vg/ml, spinn ner viruset till en slutlig volym på cirka 1 ml.
Beroende på vilken serotyp som används och hur effektivt viruset är kan du behöva koncentrera viruset i en mindre volym. - Använd en p1000 mikropipett för att överföra den koncentrerade AAV från toppen av centrifugalfiltret till ett mikrocentrifugrör. Använd en p200-mikropipett för att tvätta centrifugalfiltret med 50 μL AAV-buffert för att samla upp eventuellt kvarvarande virus och poola med resten av den koncentrerade AAV:n.
- Avsätt en alikvot på 2 μl av det koncentrerade AAV-värdet för titrering. Se tilläggstabell 1 för att se ITR-primers som kan användas för qPCR.
- För den koncentrerade AAV:n genom ett 0,2 μm sprutfilter för att sterilisera den.
OBS: Vid sterilisering av en liten volym, var noga med att välja ett sprutfilter med liten diameter för att minimera virusförlusten. Användning av ett lågproteinbindande filter med liten diameter kommer att resultera i minimal virusförlust (data visas inte). - Den steriliserade AAV:n kan användas omedelbart för att transducera celler eller förvaras vid 4 °C för användning inom fyra veckor. Den bör förvaras vid -70 °C för längre förvaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna metod kan användas för att erhålla titrar på minst 1012 viruspartiklar per ml. En titer kan erhållas (figur 3) genom qPCR med hjälp av de ITR-primrar som anges i tilläggstabell 1, genom ddPCR eller genom någon annan titreringsmetod. Suboptimala titrar kan bero på att man använder en kapsylgen som kodar för en kapsid med dålig förpackningseffektivitet.
En annan möjlig källa till suboptimala resultat är den dåliga transduktionseffektiviteten hos Expi293-celler. Det rekommenderas att ha celler med en densitet på 3-4 x 106 vc/ml på transfektionsdagen och att cellviabiliteten är nära 98%. I den aktuella studien erhöll författarna en titer på 1,07 x 1012 vg enligt detta protokoll. Detta utbyte överensstämmer med tidigare utbyten som erhållits från förpackning AAVrh7418.
Figur 3: Titerbestämning med qPCR. Kurva 1 genererades med en standardkoncentration på 3,66 x 1011 vg/ml, kurva 2 genererades med en standardkoncentration på 3,66 x 1010 vg/ml, kurva 3 var det slutliga koncentrerade AAV-provet, kurva 4 genererades med en standardkoncentration på 3,66 x 109 vg/ml och kurva 5 genererades med en standardkoncentration på 3,66 x 108 vg/ml. Varje qPCR-reaktion utfördes i två exemplar. (A) qPCR-förstärkningskurva. Standarder genererades genom seriell utspädning av en AAV-standard med ddPCR. Koncentrationen av den outspädda standarden var 3,66 x 1012 vg/ml. (B) Standardkurva genererad av qPCR. Det producerade AAV-värdet bestämdes ha en koncentration på 1,85 x 1011 vg/ml i 5,75 ml, vilket ger ett totalt utbyte på 1,07 x 1012 vg. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggstabell 1: Framåt- och bakåtriktade primersekvenser för AAV-inverterade terminalupprepningar (ITR). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet för dubbel joddensitetsgradientrening är den universella metoden eftersom det är tillämpligt på alla AAV-mutantvarianter, oavsett deras receptorspecificitet. Tidiga metoder för AAV-rening förlitade sig på partikeldensitet och inkluderade isopyklonisk centrifugering i CsCl och kontinuerlig sackarosdensitetsgradientcentrifugering19. Senare utvecklades serotypspecifika metoder, som använde sig av monoklonala antikroppar bundna till Sepharose kolumn20. En ny densitetsbaserad reningsmetod med en diskontinuerlig jodixanolgradient utvecklades 1999 och gav AAV-isolat med högre infektionsförmåga än de som isolerats från CsCl-gradienter21. Metoder för att rena AAV fortsatte att utvecklas i början av 2000-talet, eftersom vissa grupper använde högpresterande vätskekromatografi för att rena rAAV med utbyte från rålysat som översteg 70 %22,23,24. Dessa metoder används fortfarande i storskaliga tillverkningsprocesser25. Trots utvecklingen av kromatografimetoder för att isolera AAV används rening genom jodixanoldensitetsgradientcentrifugering fortfarande i stor utsträckning på grund av dess lägre kostnad och serotypagnosticism26,27.
Även om denna metod är väl lämpad för den tidseffektiva prekliniska produktionen av rAAV, är den mycket begränsad i sin skalbarhet och förmåga att anpassas för cGMP-tillverkning25. Således, som beskrivits ovan, är andra reningsmetoder att föredra för storskalig produktion. Dessutom är transgenkapaciteten hos rAAV-vektorer begränsad. Storleksgränsen för ett AAV-genom som kan förpackas intakt har visat sig vara cirka 5,2 kb, för en maximal transgenstorlek på 4,9 kb, med hänsyn till ITR6. Detta komplicerar uttrycket av proteiner vars cDNA överskrider denna kapacitet. Dessa proteiner kan inte uttryckas av det system som beskrivs här utan modifiering av själva transgenen eller användning av ett delat vektorsystem. Chamberlain et al. beskriver flera metoder för att uttrycka transgener större än 4,9 kb28.
Denna metod är särskilt användbar för produktion av kombinatoriska kapsidbibliotek med hög komplexitet som innehåller AAV-kapsider med varierande biokemiska egenskaper på grund av mutationer som finns på kapsidytan. Om rAAV-preparatet är avsett för injektion på djur, särskilt hos icke-mänskliga primater, är det viktigt att begränsa endotoxinkontamineringen. Stor försiktighet måste iakttas för att separera områden som används för att odla bakteriekulturer från rAAV-produktion för att förhindra bakteriell kontaminering under alla steg. Utför allt arbete med mänskliga celler och rå AAV i ett biosäkerhetsskåp med engångsplast. Detta förhindrar bakteriell kontaminering och är en nödvändighet för att arbeta med AAV, eftersom det är ett BSL1-medel.
Om ett laboratorium inte har tillgång till en CO2 -inkubator med en shaker kan vidhäftande cellodling med HEK293-celler användas i stället för Expi293 suspensionscellodling. Följ tillverkarens instruktioner för subkultivering och använd transfektionsprotokollet som beskrivs i Crosson et al., 201817.
Kritiska steg i detta protokoll är Expi293-transfektion, beredning av jodixanolgradienten och aspiration av jodixanolfraktionen som innehåller AAV. Fel under något av dessa steg kan resultera i icke-optimala rAAV-avkastningar eller att rAAV inte kan produceras.
Transfektion av Expi293-cellerna är ett kritiskt steg i produktionen av rAAV med hjälp av detta protokoll. På transfektionsdagen återsuspenderas cellerna i en halv volym färskt medium för att förse dem med de näringsämnen som är nödvändiga för att återhämta sig från transfektion29; Transfektion är en mycket påfrestande process för cellerna. Det konditionerade mediet kasseras dock inte helt eftersom det innehåller tillväxtfaktorer och andra metaboliter som är viktiga för cellunderhåll och tillväxt. Det är viktigt att PEI och DNA inkuberas i hela tio minuter innan de appliceras på celler för att bilda ett laddat komplex30. Utan att bilda ett komplex med PEI kommer DNA inte att tas upp effektivt av celler.
Vid produktion av rAAV beror andelen virus som finns i mediet på den specifika serotypens interaktioner med Expi293-cellreceptorer. Vissa serotyper frisätts i cellmedia i högre takt än andra31, vilket gör det nödvändigt att fälla ut viruspartiklar från cellmedia för att fånga upp högsta möjliga utbyte och förhindra förlust av varianter baserat på bristande affinitet för Expi293-cellreceptorer. Däremot har serotypen AAV2 starka receptorinteraktioner med heparansulfatproteoglykaner som finns i 293 celler, så mycket lite förpackat virus finns i mediet32. När du producerar ett derivat av AAV2, utelämna PEG-utfällningssteget. För produktion av kombinatoriska kapsidbibliotek eller rAAV av alternativa serotyper är utfällning av viruspartiklar med PEG lämplig.
Det är viktigt att 1 M natriumklorid finns i 15 % jodixanolfraktionen för att disassociera aggregerade AAV-partiklar under ultracentrifugering. Utelämnandet av NaCl i denna fraktion kan leda till oönskade resultat, såsom minskningar av transduktionseffektivitet och immunogenicitet33. Slutligen, var mycket försiktig med att aspirera AAV från jodixanolgradienten. Aspirering av för mycket av jodixanolfraktionen kan resultera i att det finns tomma kapsider i slutprodukten17.
Denna metod kan användas för att paketera rAAV-kombinatoriska kapsidbibliotek för användning i nedströmsriktade evolutionsexperiment för att identifiera kapsider med högre tropism för vissa humana celltyper. rAAV är stabil vid 4 °C för kortvarig användning och vid -70 °C för långtidsförvaring34. För närvarande används den rekombinanta AAV:n i fem FDA-godkända läkemedel som behandlar tillstånd inklusive Duchennes muskeldystrofi 35,36,37. Det finns flera ytterligare rAAV-behandlingar i kliniska och prekliniska prövningar 38,39,40. Ytterligare forskning på denna vektor är därför avgörande för utvecklingen av ytterligare genterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden att rapportera.
Acknowledgments
Ingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
- Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
- Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S. Focused update on AAV-based gene therapy clinical trials for inherited retinal degeneration. BioDrugs. 34 (6), 763-781 (2020).
- George, L. A., et al. Multiyear factor VIII expression after AAV gene transfer for hemophilia A. N Engl J Med. 385 (21), 1961-1973 (2021).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a vector for gene therapy. Biodrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Atchison, R. W., Casto, B. C., Hammon, W. M. cD.
- Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
- Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu Rev Virol. 1 (1), 427-451 (2014).
- Zolotukhin, S. Production of recombinant adeno-associated virus vectors. Hum Gene Ther. 16 (5), 551-557 (2005).
- Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N., Ayuso, E. Pharmacology of recombinant adeno-associated virus production. Mol Ther - Methods Clin Dev. 8, 166-180 (2018).
- Costa-Verdera, H., et al. Understanding and Tackling immune responses to adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 836-852 (2023).
- Ertl, H. C. J. Mitigating serious adverse events in gene therapy with AAV Vectors: Vector dose and immunosuppression. Drugs. 83 (4), 287-298 (2023).
- Pupo, A., et al. AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy. Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).
- Marsic, D., et al. Vector design tour de force: Integrating combinatorial and rational approaches to derive novel adeno-associated virus variants. Mol Ther. 22 (11), 1900-1909 (2014).
- Grimm, D., Zolotukhin, S. E Pluribus Unum: 50 Years of research, millions of viruses, and one goal-tailored acceleration of AAV evolution. Mol Ther. 23 (12), 1819-1831 (2015).
- Biswas, M., et al. Engineering and in vitro selection of a novel AAV3B variant with high hepatocyte tropism and reduced seroreactivity. Mol Ther - Methods Clin Dev. 19, 347-361 (2020).
- Perabo, L., et al. In vitro selection of viral vectors with modified tropism: the adeno-associated virus display. Mol Ther. 8 (1), 151-157 (2003).
- Crosson, S. M., Dib, P., Smith, J. K., Zolotukhin, S. Helper-free production of laboratory grade AAV and purification by iodixanol density gradient centrifugation. Mol Ther - Methods Clin Dev. 10, 1-7 (2018).
- Chan, C., Harris, K. K., Zolotukhin, S., Keeler, G. D. Rational design of AAV-rh74, AAV3B, and AAV8 with limited liver targeting. Viruses. 15 (11), 2168 (2023).
- Schmidt, O. W., Cooney, M. K., Foy, H. M. Adeno-associated virus in adenovirus type 3 conjunctivitis. Infect Immun. 11 (6), 1362-1370 (1975).
- Grimm, D., Kern, A., Rittner, K., Kleinschmidt, J. A. Novel tools for production and purification of recombinant adenoassociated virus vectors. Hum Gene Ther. 9 (18), 2745-2760 (1998).
- Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
- Clark, K. R., Liu, X., Mcgrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
- Debelak, D., et al. Cation-exchange high-performance liquid chromatography of recombinant adeno-associated virus type 2. J Chromatogr B Biomed Sci App. 740 (2), 195-202 (2000).
- Burova, E., Ioffe, E. Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications. Gene Ther. 12 (1), S5-S17 (2005).
- Adams, B., Bak, H., Tustian, A. D. Moving from the bench towards a large scale, industrial platform process for adeno-associated viral vector purification. Biotechnol Bioeng. 117 (10), 3199-3211 (2020).
- Grieger, J. C., Choi, V. W., Samulski, R. J. Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 1 (3), 1412-1428 (2006).
- Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 28, 146-159 (2022).
- Chamberlain, K., Riyad, J. M., Weber, T. Expressing transgenes that exceed the packaging capacity of adeno-associated virus capsids. Hum Gene Ther Methods. 27 (1), 1-12 (2016).
- Green, E. A., Hamaker, N. K., Lee, K. H. Comparison of vector elements and process conditions in transient and stable suspension HEK293 platforms using SARS-CoV-2 receptor binding domain as a model protein. BMC Biotechnol. 23 (1), 7 (2023).
- Erbacher, P., Zou, S., Bettinger, T., Steffan, A. M., Remy, J. S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: Biophysical characteristics and transfection ability. Pharm Res. 15 (9), 1332-1339 (1998).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Hum Gene Ther. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Summerford, C., Samulski, R. J. Membrane-associated heparan sulfate proteoglycan is a receptor for adeno-associated virus type 2 virions. J Virol. 72 (2), 1438-1445 (1998).
- Wright, J. F., et al. Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation. Mol Ther. 12 (1), 171-178 (2005).
- Gruntman, A. M., et al. Stability and compatibility of recombinant adeno-associated virus under conditions commonly encountered in human gene therapy trials. Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 71-76 (2015).
- Srivastava, A. Rationale and strategies for the development of safe and effective optimized AAV vectors for human gene therapy. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 949-959 (2023).
- Mullard, A. FDA approves first gene therapy for Duchenne muscular dystrophy, despite internal objections. Nat Rev Drug Discov. 22 (8), 610-610 (2023).
- Center for Biologics Evaluation and Research. Approved Cellular and Gene Therapy Products. US Food Drug Adm. , (2023).
- Kang, L., et al. AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges. J Control Release Off J Control Release Soc. 355, 458-473 (2023).
- De Wolf, D., Singh, K., Chuah, M. K., VandenDriessche, T. Hemophilia gene therapy: The end of the beginning. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 782-792 (2023).
- Simons, E. J., Trapani, I. The opportunities and challenges of gene therapy for treatment of inherited forms of vision and hearing loss. Hum Gene Ther. 34 (17-18), 808-820 (2023).
