Summary
アデノ随伴ウイルスは浮遊細胞培養で産生され、二重ヨージキサノール密度勾配遠心分離によって精製されます。ウイルスの総収量を増やし、ウイルス沈殿のリスクを低減し、最終的なウイルス生成物をさらに濃縮するためのステップが含まれています。予想される最終力価は10,12 ウイルス粒子/mLに達し、前臨床 in vivo での使用に適しています。
Abstract
このプロトコルはiodixanol密度勾配の遠心分離、1999年に最初に記述されているAAVを浄化する血清型不可知論者方法によって組換えのadeno準のウイルス(rAAV)の生産そして浄化を記述する。rAAVベクターは、さまざまなヒト細胞タイプに導入遺伝子を送達するための遺伝子治療アプリケーションで広く使用されています。本研究では、導入遺伝子、ベクターカプシド、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子をコードするプラスミドを用いた浮遊培養中の Expi293 細胞のトランスフェクションにより、組換えウイルスを産生します。ヨウジオジキサノール密度勾配遠心分離は、粒子密度に基づいて完全なAAV粒子を精製します。さらに、この今ではユビキタスな方法論には、総ウイルス収量の増加、汚染タンパク質による沈殿のリスクの低減、および最終的なウイルス生成物のさらなる濃縮のために、それぞれ3つのステップが含まれています:ポリエチレングリコール(PEG)と塩化ナトリウムの溶液を使用した細胞培地からのウイルス粒子の沈殿、2回目のヨージキサノール密度勾配遠心分離の導入、 遠心フィルターによる緩衝液交換。この方法を用いることで、in vivoでの使用において、10〜12個のウイルス粒子/mLの並外れた純度の力価を一貫して達成することができます。
Introduction
組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)ベクターは、脊髄性筋萎縮症、網膜ジストロフィー、血友病A1,2,3などの遺伝性疾患の治療に広く使用されているツールです。rAAVベクターは、直鎖状の一本鎖4.7 kbのDNAゲノムを持つ小型の非エンベロープ正二十面体ウイルスである野生型AAV4に存在するウイルス遺伝子を欠くように操作されています。AAVは、1960年代にアデノウイルス製剤の汚染物質として初めて発見されました5。AAVはキャプシドサイズが小さいため、パッケージ化できる導入遺伝子のサイズはITRを除いて最大4.9 kbに制限されますが6、ヒトでは非病原性であり、多くの分裂細胞および非分裂細胞タイプで導入遺伝子の発現を可能にし、免疫原性効果が限られているため、導入遺伝子の送達に有用です7。
dependoparvovirus属のメンバーとして、rAAVの産生は、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスに存在するヘルパー遺伝子の発現に依存しています8。rAAVを産生するいくつかの戦略が開発されていますが、アデノウイルスE1A/E1Bヘルパー遺伝子で形質転換されたHEK293細胞での産生は、現在最も確立された方法です9。rAAV産生の一般的なアプローチは、HEK293細胞を、それぞれ逆末端反復配列(ITR)、AAV rep 遺伝子および cap 遺伝子、および追加のアデノウイルスヘルパー遺伝子内に導入遺伝子を含む3つのプラスミドを用いてトランスフェクションすることから始まります。トランスフェクションの72時間後に細胞を回収し、導入遺伝子を含むrAAVを精製するためにプロセシングします。
治療目的の新しいrAAVベクターの開発では、形質導入効率を高めたベクターを作製することが大きな目標となっています。標的細胞の形質導入効率の向上は、rAAVの必要臨床用量の減少を意味し、したがって、抗体媒介性中和から急性毒性に至るまでの免疫原性への悪影響の可能性を減少させるであろう10,11。rAAVベクターの形質導入効率を向上させるために、パッケージ化されたゲノムまたはカプシドに改変を加えることができます。パッケージ化されたゲノム設計によって形質導入の有効性を調整する実行可能な方法には、強力な組織特異的プロモーターの組み込み、mRNAプロセシングエレメントの慎重な選択、および翻訳効率を向上させるためのコード配列の最適化が含まれます12。カプシドの改変は、標的となるヒト細胞タイプの向性を高めることを目的として行われます。新しいrAAV導入遺伝子導入ベクターカプシドの開発に向けた取り組みは、一般に、特定の細胞受容体を標的とする特定の変異を持つAAVカプシドの合理的な設計、または1つの特定の受容体を標的とせずに、非常に複雑なコンビナトリアルカプシドライブラリから特定の細胞タイプに対して向性を持つカプシドを同定するための指向性進化のいずれかに焦点を当てることによって特徴付けられます(ただし、これらのアプローチを組み合わせるグループもあります)13。14,15。指向性進化アプローチでは、コンビナトリアルカプシドライブラリは、カプシド外装16に変異した可変領域を有する特定の血清型骨格を用いて構築される。コンビナトリアルカプシドライブラリーは、ヒトに由来しないAAV血清型から構築されることが多く、臨床使用中の既存の免疫のリスクを低減します10。したがって、あらゆる血清型に適用できる精製法は、これらのライブラリのバックボーンとして機能する、あまり一般的に使用されない血清型に対する血清型特異的な最適化の必要性を排除するのに理想的です。
ヨウ素酸塩密度勾配遠心分離は、感染力の高いrAAVの高力価を精製するために利用される17。このプロトコルでは、rAAVはAAVの大きな力価を生成するために必要な労働量を減らすために、浮遊細胞培養で産生されます。また、細胞溶解液を除去するための遠心分離ステップも含まれており、汚染タンパク質の存在を減らし、ウイルス沈殿のリスクを低減します。このプロトコルは、前臨床使用に適した高純度rAAVの調製物を製造するための費用対効果の高い方法です。
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Protocol
このプロトコルで使用した溶液および緩衝液の組成を 表1に示します。
| 解決 | 組成 | |
| AAV溶解バッファー | 1.2 mL の 5 M NaCl 溶液 | |
| 2 mL の 1 M Tris-HCl pH 8.5 溶液 | ||
| 80 uL の 1 M MgCl2 溶液 | ||
| mQ 水から 40 mL まで | ||
| AAV沈殿液 | 40グラムペグ8000 | |
| 50 mL の 5 M NaCl 溶液 | ||
| mQ 水から 100 mL | ||
| 15%ヨジキサノール画分。 | 7.5 mL オプティプレップ | |
| 3 mL の 10X DPBS | ||
| 6 mL の 5 M NaCl 溶液 | ||
| 30 uL の 1 M MgCl2 溶液 | ||
| mQから30 mL | ||
| 25%イオジキサノール画分 | 12. 5 mL OptiPrep (オプティプレップ) 5 mL | |
| 3 mL の 10X DPBS | ||
| 30 uL の 1 M MgCl2 溶液 | ||
| 60 uL フェノールレッド溶液 | ||
| mQから30 mL | ||
| 40%ヨジキサノール画分 | 33.3 mLのOptiPrep | |
| 5 mL の 10X DPBS | ||
| 50 uL の 1 M MgCl2 溶液 | ||
| mQから50 mL | ||
| 60%ヨジキサノール画分 | 50 mLのOptiPrep | |
| 100 μL フェノールレッド溶液 | ||
| AAV緩衝液 | 8 mL の 5 M NaCl | |
| 20 uL の 10% プルロニック F-68 | ||
| PBSから200 mL | ||
表1:このプロトコルで使用される溶液の溶液組成。
1. Expi293 細胞のトリプルトランスフェクション
- Expi293 細胞 ( 材料表を参照) を初期密度 5 x 105 生細胞 (vc)/mL で播種します。
- 細胞を37°C、8%CO2 、125rpmのシェーカー速度で、密度が3-5 x 106 vc/mLになるまでインキュベートします。自動セルカウンターでトリパンブルー排除を使用して細胞密度と生存率をモニターします( 材料表を参照)。
- 細胞が目的の細胞密度に達したら、総体積が元の体積の10倍になるように、新しい培地を追加して細胞を1〜10に分割します。必要に応じて、細胞をより大きなフラスコに移します。インキュベーションに戻ります。
- ステップ 1.2-1.3 の説明に従って、1 L フラスコ内の培地 250 mL の培地で少なくとも 2 x 106 vc/mL の密度に達するまで、細胞を増殖させ続けます。
- トランスフェクションの前日に、細胞を250 mLの培地で2 x 106 vc/mLに希釈し、必要に応じて余分な細胞を廃棄します。細胞を一晩インキュベートします。
- トランスフェクション当日に、細胞の半分を58 x g で18°Cで5分間遠心分離します。 細胞ペレットを同容量(125 mL)の新鮮な培地に再懸濁します。細胞生存率は98%に近いはずです。
- 50 mL コニカルチューブを 2 本用意します。一方を「PEI」、もう一方を「DNA」とラベル付けします。
- PEIとラベル付けされたコニカルチューブで、1.2 mLのPEI(ポリエチレンイミン、 材料表を参照)をOptiMEM培地で総容量12.5 mLに希釈します。
- DNAを標識したコニカルチューブで、プラスミドDNAと合計500 μgのDNAをOptiMEM培地で総容量12.5 mLに調製します。
- PEI溶液にDNA溶液を加え、数回反転させて完全に混ぜ合わせ、室温で10分間インキュベートします。
注:PEIがDNAと荷電複合体を形成するためには、DNA-PEI溶液を10分間インキュベートすることが重要です。 - DNA-PEI 溶液を 10 分間インキュベートした後、血清ピペットを使用して、DNA-PEImax 溶液を Expi293 細胞にゆっくりと塗布します。トランスフェクションした細胞をインキュベーターに戻し、72時間インキュベートします(図1)。
図1:トランスフェクションの2日後にGFPを発現したExpi293細胞。 GFP の遺伝子を含むプラスミドでトランスフェクションした後、Expi293 細胞は一過性に eGFP を発現します。細胞の形態は丸いです。画像は15msの露光時間で撮影されました。顕微鏡画像は、落射蛍光照明と10倍/0.30対物レンズを備えた倒立顕微鏡を使用して取得されます。スケールバー = 100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
2. rAAVベクター精製
- 72時間後、懸濁液中の細胞を2本の250 mLコニカルチューブに移し、415 x g で4°Cで10分間スピンダウンします。
- 上清培地を新しい500 mLのコニカルチューブに注ぎ、後で処理するために氷上で0°Cで保存します。
- 各細胞ペレットを10 mLのAAV溶解バッファーに再懸濁します(表1)。2つのライセートをチューブの1つに一緒にプールします。もう一方のチューブを追加の 5 mL の AAV 溶解バッファーで洗浄し、プールした溶解物に加えます。-70°Cで凍結します。
注: この時点で実験を一時停止できます。上清培地は氷上ではなく-70°Cで保存してください。 - ステップ2.2の上清培地に1:4容量のAAV沈殿液を加えます。数回反転させて十分に混合し、氷上で0°Cで少なくとも2時間または一晩インキュベートします。
- インキュベートした溶液を3000 x g で4°Cで1時間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、ウイルス沈殿物を含むペレットを 5 mL の AAV 溶解バッファーに再懸濁します。
- 細胞ライセートをウォーターバス中で37°Cで融解します。
- ウイルス沈殿物を細胞溶解物とプールします。これが粗溶解物です。ウイルス沈殿物を含む遠心分離チューブを、さらに5 mLのAAV溶解バッファーで洗浄し、粗溶解液でプールします。
- 粗溶解液を-70°Cに凍結し、37°Cで解凍します。 このサイクルをもう一度繰り返します。
注:粗溶解液は、解凍に必要な時間を超えて37°Cに放置しないでください。 - 3回目の解凍後、直ちに4 μLのベンゾナーゼを粗溶解液に添加し、反転させて混合し、37°Cで30分間インキュベートします。
- 粗溶解液を18°C、650 x g で10分間遠心分離します。
- 上清を清潔な50 mLコニカルチューブに移します。これが粗雑なウイルスです。ペレットを廃棄します。
- 粗ウイルスを18°C、3000 x g でさらに30分間遠心分離し、汚染タンパク質を除去します。
- 上清を清潔な50 mLコニカルチューブに移します。これが解明されたウイルスです。
注: この時点で実験を一時停止できます。清澄化したウイルスを-70°Cまで凍結します。 - 4本の蠕動チューブを備えたマルチチャンネル蠕動ポンプをセットアップします( 材料表を参照)。各チューブの両端にキャピラリーを取り付けます。
- ポンプの入力側のキャピラリーを、脱イオン水で満たされたビーカーに入れます。ポンプの出力側のキャピラリーを空のビーカーに入れます。蠕動ポンプを25.0rpmで運転し、チューブを脱イオン(DI)水で洗い流します。
- 完全に洗い流されたら、チューブが空気のみで満たされるまでポンプを作動させて、チューブを空にします。すべてのキャピラリーを糸くずの出ない清潔なワイプの上に置きます。
- ポンプの出力側のラックに4本の超遠心チューブを配置します。
- 10 mLの血清ピペットを使用して、10 mLの清澄化ウイルスを各超遠心チューブに慎重に分注します。気泡が入らないように注意してください。
注:各チューブ内の清澄化ウイルスの量は、必要に応じてチューブあたり最大12 mLまで伸ばすことができます。以下のステップ2.25で60%イオジキサノールの量を適切に減らします。 - 清澄化したウイルスは、蠕動ポンプを用いて、低密度から最高密度までのヨジキサノール画分(表1)を下敷きにします。最初に15%の画分が追加され、次に25%の画分、40%の画分、最後に60%の画分が加算されます。22 mL(超遠心チューブあたり5.5 mL)の15%ヨジジキサノール画分を清潔な50 mLコニカルチューブに移します。ポンプの入力側にあるキャピラリーをチューブに配置し、すべてのキャピラリーがチューブの底部に接触するように注意します。
- ポンプを始動し、チューブにイオジキサノール画分を充填します。ヨウジキサノール画分がポンプの出力側の毛細血管の末端に達したら、ポンプを停止します。
- 1つの出力キャピラリーを、透明化したウイルスが入った各超遠心チューブに挿入し、キャピラリーが各超遠心チューブの底部に触れているようにします。
注意: キャピラリーに空気が残っていないことが非常に重要です。ヨウジキサノールは、わずかに異なる速度で蠕動チューブ内を流れる可能性があるため、清澄化されたウイルスに挿入する前に、個々の出力キャピラリーがヨウジキサノールで完全に満たされていることを確認してください。ポンプを数回停止および始動する必要がある場合があります。 - ポンプを始動し、超遠心チューブを充填します。最後の15%画分がインプットキャピラリーに取り込まれる寸前になったら、ポンプを停止します。蠕動チューブに気泡が入らないことが重要です。
注意: 気泡が入力キャピラリーに入った場合、ポンプを逆方向に短時間作動させて、気泡を押し戻すことができます。 - 22 mL(超遠心チューブあたり5.5 mL)の25%ヨジキサノール画分を50 mLのコニカルチューブに移します。すべてのキャピラリーがチューブの底に触れているように注意し、ポンプを始動します。最後の25%画分がインプットキャピラリーに取り込まれる寸前になったら、ポンプを停止します。
- 40%イオジキサノール画分を20 mL(超遠心チューブあたり5 mL)でステップ2.24を繰り返し、次に60%画分を24 mL(超遠心チューブあたり6 mL)で繰り返します。
- 超遠心チューブにまだ未充填の容量が残っている場合は、超遠心チューブが液体で完全に満たされるまで、60%フラクションをさらに追加し続けます。
- ライセートが上部にドームを作り、チューブからあふれ出さなくなるまで、各チューブを満たします。ポンプを停止し、イオジキサノールの勾配を乱さないように注意しながら、各出力キャピラリーを慎重に取り外します。
- 各超遠心チューブをスペーサーでキャップし、タイプ70 Tiローターに装填します( 材料表を参照)。
注意: ローターのバランスが適切であることを確認してください。適切なトレーニングを受けずに超遠心分離機を操作しようとしないでください。 - タイプ70 Tiローターを超遠心分離機にロードし、489,000 x g で18°Cで1時間遠心分離します。
- 遠心分離後、ローターを超遠心分離機から降ろします。ラジオペンチを使用して、ヨージキサノールの勾配を乱さないように注意しながら、各超遠心チューブをローターから慎重に取り外します。
- クランプ付きのサポートリングスタンドを使用して、1本の超遠心チューブを固定します。
- 20 GA の針を 5 mL のシリンジに取り付け、取っておきます。糸くずの出ないワイプを使用して、超遠心チューブからキャップを取り外します。
- 40%〜60%のヨジキサノール界面の約3mm下の針で超遠心チューブの壁を貫通します(図2)。
- 界面と40%画分の一部をゆっくりと吸引します。40%フラクションの上部を吸引することは避け、合計で約4 mLを吸引します。
- 超遠心チューブの開いた上部を指1本で押さえながら、シリンジを引き出し、吸引したAAV画分を50 mLのコニカルチューブに移します。シリンジは鋭利な容器に廃棄してください。.超遠心チューブを廃棄します。
- 各超遠心チューブについて、手順2.31〜2.35を繰り返します。
- 吸引したAAV画分をAAV溶解緩衝液で約2倍に希釈し、40 mLの容量にします。
- ステップ2.16-2.17の説明に従って、蠕動チューブを洗い流します。
注: この時点で実験を一時停止できます。希釈したAAV画分を0°Cで一晩保存します。 - 希釈したAAV画分をそれぞれ20 mLずつ、2本の新しい超遠心チューブにロードします。
- 2回目のヨウジオジキサノール密度勾配遠心分離では、40%画分の10 mL(超遠心チューブあたり5 mL)および60%画分の14 mL(超遠心チューブあたり7 mL)のみを使用して、上記のように希釈したAAVフラクションを下敷きにします。ステップ2.29〜2.36を繰り返して、超遠心分離と吸引を行います。
注意: 蠕動ポンプとチューブを保管する前に、手順2.16-2.17の説明に従って、チューブを脱イオン水で洗い流してください。
図2:40%〜60%のヨージキサノール界面を標識したヨウジキサノールグラジエント。 (A)第1のイオジキサノールグラジエント。フェノールレッドは、40%のイオジキサノールと60%のヨジキサノール留分に使用されています。2つの画分間のpHの違いにより、異なる色として表示されます。矢印は、40%〜60%のヨジキサノール界面のすぐ下、rAAV画分を採取するためにシリンジを挿入する場所を示しています。(B)第2のイオジキサノール勾配。このステップでは、40%および60%のイオジキサノール画分のみを使用します。矢印は、rAAV画分を採取するためにシリンジを挿入する場所を示しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
3. 緩衝液交換とウイルス濃縮
- 2回目のヨウジキサノール密度勾配遠心分離でAAV画分を得た後、AAV緩衝液で2倍に希釈します。
- 遠心フィルターの上部に20 mLのAAV緩衝液を添加して、遠心フィルターを平衡化します。装置を3000 x g 、18°C、5分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
- 希釈したAAV画分を遠心フィルターに加えます。装置を3000 x g 、18°C、5分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
- フィルターの上部に 20 mL の AAV 緩衝液を加えます。装置を3000 x g 、18°C、5分間遠心分離し、フロースルーを廃棄します。
注:遠心フィルターメンブレンが詰まり、溶液が効率的に流れない場合は、P200マイクロピペットを慎重に使用して、フィルターの上部で溶液を上下に吸い上げます。マイクロピペットチップでフィルターに触れないように細心の注意を払ってください。 - 手順 3.4 をさらに 2 回繰り返します。
注意: フィルターの上部に少なくとも1 mLの容量を維持して、AAVが過度に濃縮されていないことを確認してください。過濃度を防ぐために遠心分離時間を調整する必要がある場合があります。AAVが過度に濃縮されると、沈殿が発生する可能性があります。 - 最終力価が1012 vg/mLの範囲の場合、ウイルスを約1 mLの最終容量までスピンダウンします。
注:使用する血清型骨格とウイルスのパッケージング効率によっては、ウイルスをより少ない量で濃縮する必要がある場合があります。 - p1000マイクロピペットを使用して、濃縮AAVを遠心フィルターの上部から微量遠心チューブに移します。p200マイクロピペットを使用して遠心フィルターを50 μLのAAVバッファーで洗浄し、残っているウイルスを回収し、残りの濃縮AAVとプールします。
- 力価測定のために、濃縮AAVの2 μLアリコートを取っておきます。qPCRに使用できるITRプライマーについては、 補足表1 を参照してください。
- 濃縮されたAAVを0.2μmのシリンジフィルターに通して滅菌します。
注:少量を滅菌する場合は、ウイルスの損失を最小限に抑えるために、直径の小さいシリンジフィルターを選択するように注意してください。小径の低タンパク質結合フィルターを使用すると、ウイルスの損失が最小限に抑えられます(データは示していません)。 - 滅菌したAAVは、すぐに細胞の形質導入に使用することも、4°Cで保存して4週間以内に使用することもできます。長期保存のために-70°Cで保管する必要があります。
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Representative Results
この方法は、mL当たり少なくとも10〜12個のウイルス粒子の力価を得るために用いることができる。力価は、補足表1に記載のITRプライマーを用いたqPCR、ddPCR、またはその他の力価法により得ることができる(図3)。最適でない力価は、パッケージング効率の悪いカプシドをコードするキャップ遺伝子を使用した場合に生じる可能性があります。
また、Expi293 細胞の形質導入効率の低さも、最適でない結果をもたらす可能性があります。トランスフェクション当日に細胞の密度が3-4 x 106 vc/mLで、細胞生存率が98%に近いことが推奨されます。本研究では、著者らは、このプロトコルに従って1.07 x 1012 vgの力価を得た。この収率は、包装 AAVrh7418 から得られた以前の収率と一致しています。
図3:qPCRによる力価測定。 曲線 1 は標準濃度 3.66 x 1011 vg/mL、曲線 2 は標準濃度 3.66 x 1010 vg/mL、曲線 3 は最終濃縮 AAV サンプル、曲線 4 は標準濃度 3.66 x 109 vg/mL、曲線 5 は標準濃度 3.66 x 108 vg/mL で生成しました。各qPCR反応は、二重に行いました。(A)qPCR増幅曲線。標準試料は、ddPCRで滴定したAAV標準試料を段階希釈して生成しました。希釈原標準試料の濃度は 3.66 × 1012 vg/mL でした。(B)qPCRで生成された検量線。生成された AAV は、5.75 mL 中に 1.85 x 1011 vg/mL の濃度を持ち、合計収量は 1.07 x 1012 vg であると決定されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足表1:AAV反転末端反復配列(ITR)の順方向および逆方向のプライマー配列。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ダブルヨージキサノール密度勾配精製プロトコルは、受容体の特異性に関係なく、あらゆるAAV変異体バリアントに適用できるため、普遍的な方法です。AAV精製の初期の方法は粒子密度に依存しており、CsClでのアイソピクニック遠心分離と連続スクロース密度勾配遠心分離が含まれていました19。その後、セファロースカラムに結合したモノクローナル抗体を利用した血清型特異的アプローチが開発された20。1999年には、不連続なヨジキサノールグラジエントを用いた新しい密度ベースの精製法が開発され、CsClグラジエントから単離されたものよりも高い感染力を持つAAV分離株が得られました21。AAVの精製法は2000年代初頭まで開発が続けられ、一部のグループは高速液体クロマトグラフィーを使用してrAAVを精製し、粗溶解液からの回収率は70%を超えました22,23,24。これらの方法は、大規模な製造プロセス25で今でも使用されています。AAVを単離するためのクロマトグラフィー法が開発されているにもかかわらず、ヨジキサノール密度勾配遠心分離による精製は、その低コストと血清型不可知論のために依然として広く使用されています26,27。
この方法は、rAAVの時間効率の高い前臨床生産には適しているが、そのスケーラビリティとcGMP製造に適応する能力は非常に限られている25。したがって、上述したように、他の精製方法が大規模生産に好ましい。さらに、rAAVベクターの導入遺伝子容量は限られています。そのままパッケージングできるAAVゲノムのサイズ制限は約5.2 kbであり、最大導入遺伝子サイズは4.9 kbであり、ITR6を考慮しています。これは、cDNAがこの容量を超えるタンパク質の発現を複雑にします。これらのタンパク質は、導入遺伝子自体を修飾するか、またはスプリットベクターシステムを使用しない限り、ここに記載のシステムでは発現できません。Chamberlainらは、4.9 kbを超える導入遺伝子を発現するいくつかの方法を記述している28。
この方法は、カプシド表面に存在する変異によりさまざまな生化学的特性を持つAAVキャプシドを含む、複雑性の高いコンビナトリアルカプシドライブラリの作製に特に有用です。rAAV製剤を動物、特にヒト以外の霊長類に注射する場合は、エンドトキシン汚染を制限することが重要です。すべてのステップで細菌汚染を防ぐために、細菌培養に使用される領域とrAAV生産を分離するために細心の注意を払う必要があります。使い捨てのプラスチック器具を使用して、バイオセーフティキャビネット内のヒト細胞と粗AAVですべての作業を行います。これは細菌汚染を防ぎ、BSL1剤であるAAVを扱うために必要です。
ラボでシェーカー付きの CO2 インキュベーターを利用できない場合は、Expi293 浮遊細胞培養の代わりに HEK293 細胞による接着細胞培養を使用できます。継代培養に関するメーカーの指示に従い、Crosson et al., 201817に記載されているトランスフェクションプロトコルを使用してください。
このプロトコルの重要なステップは、Expi293 トランスフェクション、イオジキサノールグラジエントの調製、AAV を含むヨジキサノール画分の吸引です。これらのステップのいずれかでエラーが発生すると、rAAVの収率が最適でなくなったり、rAAVの生成に失敗したりする可能性があります。
Expi293 細胞のトランスフェクションは、このプロトコルを用いた rAAV の産生における重要なステップです。トランスフェクションの日に、細胞はトランスフェクションからの回復に必要な栄養素を細胞に与えるために、半分の量の新鮮な培地に再懸濁されます29。トランスフェクションは、細胞にとって非常に負担のかかるプロセスです。しかし、馴化培地は、細胞の維持と増殖に重要な成長因子やその他の代謝産物を含んでいるため、完全に廃棄されるわけではありません。荷電複合体を形成するためには、PEIとDNAを細胞に適用する前に、10分間インキュベートすることが重要である30。PEIと複合体を形成しなければ、DNAは細胞に効率的に取り込まれません。
rAAV を産生する場合、培地中に検出されるウイルスの割合は、特定の血清型と Expi293 細胞受容体との相互作用によって異なります。一部の血清型は他の血清型よりも高い速度で細胞培地に放出されるため31、可能な限り高い収量を捕捉し、Expi293細胞受容体に対する親和性の欠如に基づく変異体の損失を防ぐために、ウイルス粒子を細胞培地から沈殿させる必要があります。対照的に、血清型AAV2は、293個の細胞に存在するヘパラン硫酸プロテオグリカンと強い受容体相互作用を有するため、培地中にパッケージ化されたウイルスはほとんど見つかっていない32。AAV2の誘導体を作製する場合は、PEG沈殿工程を省略する。コンビナトリアルカプシドライブラリーまたは代替血清型のrAAVの産生には、PEGによるウイルス粒子の沈殿が適切です。
15%のヨジキサノール画分に1 Mの塩化ナトリウムが存在することは、超遠心分離中に凝集したAAV粒子を解離するために重要です。この画分におけるNaClの欠落は、形質導入効率や免疫原性の低下など、望ましくない結果をもたらす可能性がある33。最後に、ヨジキサノールグラジエントからAAVを吸引する際には細心の注意を払ってください。ヨジキサノール画分を吸引しすぎると、最終生成物中に空のカプシドが存在する可能性があります17。
この分析法は、特定のヒト細胞タイプについてより高い屈性を持つカプシドを同定するための下流方向の進化実験で使用するために、rAAVコンビナトリアルカプシドライブラリをパッケージ化するために使用できます。rAAVは、短期使用では4°C、長期保存では-70°Cで安定している34。現在、組換えAAVは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー35,36,37を含む症状を治療する5つのFDA承認薬に使用されています。臨床試験および前臨床試験には、いくつかの追加のrAAV療法があります38,39,40。したがって、このベクターのさらなる研究は、さらなる遺伝子治療の開発に不可欠です。
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Disclosures
著者らは、報告すべき開示事項を持っていない。
Acknowledgments
何一つ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
References
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