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सस्पेंशन कल्चर प्रोडक्शन एंड प्यूरीफिकेशन ऑफ एडेनो-एसोसिएटेड वायरस बाय Iodixanol डेंसिटी ग्रेडिएंट सेंट्रीफ्यूजेशन इन विवो एप्लीकेशंस

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/66460
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pediatrics, University of Florida

Summary

एडेनो-जुड़े वायरस निलंबन सेल संस्कृति में उत्पन्न होते हैं और डबल आयोडिक्सानोल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्ध होते हैं। कुल वायरस उपज बढ़ाने, वायरस वर्षा के जोखिम को कम करने और अंतिम वायरस उत्पाद को और अधिक केंद्रित करने के लिए कदम शामिल किए गए हैं। अपेक्षित अंतिम टाइटर्स 1012 वायरल कणों/एमएल तक पहुंचते हैं और विवो उपयोग में पूर्व-नैदानिक के लिए उपयुक्त होते हैं।

Abstract

यह प्रोटोकॉल पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरस (आरएएवी) उत्पादन और आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्धिकरण का वर्णन करता है, जो पहली बार 1999 में वर्णित एएवी को शुद्ध करने की एक सीरोटाइप-अज्ञेयवादी विधि है। आरएएवी वैक्टर का व्यापक रूप से जीन थेरेपी अनुप्रयोगों में विभिन्न मानव कोशिका प्रकारों में ट्रांसजीन देने के लिए उपयोग किया जाता है। इस काम में, पुनः संयोजक वायरस ट्रांसजीन, वेक्टर कैप्सिड और एडेनोवायरल हेल्पर जीन को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिड के साथ निलंबन संस्कृति में Expi293 कोशिकाओं के अभिकर्मक द्वारा निर्मित होता है। Iodixanol घनत्व ढाल centrifugation कण घनत्व के आधार पर पूर्ण AAV कणों को शुद्ध करता है। इसके अतिरिक्त, कुल वायरस उपज बढ़ाने के लिए इस अब-सर्वव्यापी पद्धति में तीन चरण शामिल हैं, दूषित प्रोटीन के कारण वर्षा के जोखिम को कम करते हैं, और क्रमशः अंतिम वायरस उत्पाद को और अधिक केंद्रित करते हैं: पॉलीथीन ग्लाइकॉल (पीईजी) और सोडियम क्लोराइड के समाधान का उपयोग करके सेल मीडिया से वायरल कणों की वर्षा, आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के दूसरे दौर की शुरूआत, और एक केन्द्रापसारक फिल्टर के माध्यम से बफर विनिमय। इस पद्धति का उपयोग करके, विवो उपयोग के लिए असाधारण शुद्धता के 1012 वायरल कणों/एमएल की सीमा में टाइटर्स को लगातार प्राप्त करना संभव है।

Introduction

पुनः संयोजक एडेनो-जुड़े वायरल (आरएएवी) वैक्टर व्यापक रूप से आनुवंशिक रोगों के उपचार के लिए उपकरण का उपयोग किया जाता है, जिसमें रीढ़ की हड्डी पेशी शोष, रेटिना डिस्ट्रोफी, और हीमोफिलिया ए 1,2,3 शामिल हैं। आरएएवी वैक्टर को जंगली-प्रकार एएवी4 में मौजूद वायरल जीन की कमी के लिए इंजीनियर किया जाता है, जो एक रैखिक एकल-फंसे 4.7 केबी डीएनए जीनोम के साथ एक छोटा, गैर-लिफाफा इकोसाहेड्रल वायरस है। एएवी को पहली बार 1960 के दशक में एडेनोवायरसतैयारी 5 के संदूषक के रूप में खोजा गया था। अपने छोटे कैप्सिड आकार के बावजूद, जो ट्रांसजीन के आकार को सीमित करता है जिसे आईटीआर6 को छोड़कर अधिकतम 4.9 केबी तक पैक किया जा सकता है, एएवी ट्रांसजीन डिलीवरी के लिए उपयोगी है क्योंकि यह मनुष्यों में गैर-रोगजनक है, कई विभाजित और गैर-विभाजित सेल प्रकारों में ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति की अनुमति देता है, और सीमित इम्युनोजेनिक प्रभाव7.

जीनस डिपेंडोपार्वोवायरस के सदस्यों के रूप में, आरएएवी का उत्पादन एडेनोवायरस या हर्पीज सिम्प्लेक्स वायरस8 में मौजूद सहायक जीन की अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। आरएएवी का उत्पादन करने के लिए कई रणनीतियों का विकास किया गया है, लेकिन एडेनोवायरल ई 1 ए / ई 1 बी हेल्पर जीन के साथ परिवर्तित एचईके 293 कोशिकाओं में उत्पादन आज इस्तेमाल की जाने वाली सबसे स्थापित विधि है9. आरएएवी उत्पादन का सामान्य दृष्टिकोण क्रमशः उल्टे टर्मिनल रिपीट (आईटीआर), एएवी प्रतिनिधि और कैप जीन, और अतिरिक्त एडेनोवायरल हेल्पर जीन के भीतर ट्रांसजीन युक्त तीन प्लास्मिड के साथ HEK293 कोशिकाओं के अभिकर्मक के साथ शुरू होता है। अभिकर्मक के बहत्तर घंटे बाद, कोशिकाओं को काटा जाता है और ट्रांसजीन युक्त आरएएवी को शुद्ध करने के लिए संसाधित किया जाता है।

चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए नए आरएएवी वैक्टर के विकास में, एक प्रमुख लक्ष्य बढ़ी हुई पारगमन दक्षता के साथ वैक्टर का उत्पादन कर रहा है। लक्ष्य कोशिकाओं के पारगमन दक्षता में वृद्धि आरएएवी के आवश्यक नैदानिक खुराक में कमी का मतलब होगा, इस प्रकार तीव्र विषाक्तता10,11 के लिए एंटीबॉडी मध्यस्थता तटस्थता से लेकर प्रतिकूल इम्युनोजेनिक प्रभाव की संभावना कम हो रही है. आरएएवी वैक्टर की पारगमन प्रभावकारिता में सुधार करने के लिए, पैक किए गए जीनोम या कैप्सिड में परिवर्तन किए जा सकते हैं। पैक जीनोम डिजाइन के माध्यम से पारगमन प्रभावकारिता धुन करने के लिए व्यवहार्य तरीकों मजबूत और ऊतक विशिष्ट प्रमोटरों, एमआरएनए प्रसंस्करण तत्वों के विचारशील चयन, और अनुवाद दक्षता12 में सुधार करने के लिए कोडिंग अनुक्रम अनुकूलन के समावेश शामिल हैं. कैप्सिड में परिवर्तन लक्ष्य मानव कोशिका प्रकारों के लिए ट्रोपिज्म बढ़ाने के लक्ष्य के साथ किए जाते हैं। नए आरएएवी ट्रांसजीन डिलीवरी वेक्टर कैप्सिड विकसित करने के प्रयासों को आम तौर पर विशिष्ट सेल रिसेप्टर्स को लक्षित करने वाले विशिष्ट उत्परिवर्तन के साथ एएवी कैप्सिड के तर्कसंगत डिजाइन पर ध्यान केंद्रित करने की विशेषता होती है या एक विशिष्ट रिसेप्टर को लक्षित किए बिना उच्च जटिलता कॉम्बिनेटरियल कैप्सिड पुस्तकालयों से विशिष्ट सेल प्रकारों के लिए ट्रोपिज्म के साथ कैप्सिड की पहचान करने के लिए निर्देशित विकास (हालांकि कुछ समूह इन दृष्टिकोणों को जोड़ते हैं)13, 14,15. निर्देशित विकास दृष्टिकोण में, combinatorial capsid पुस्तकालयों capsid बाहरी16 पर उत्परिवर्तित चर क्षेत्रों के साथ एक विशेष सीरोटाइप रीढ़ का उपयोग कर निर्माण कर रहे हैं. कॉम्बिनेटरियल कैप्सिड पुस्तकालयों का निर्माण अक्सर एएवी सीरोटाइप से किया जाता है जो मनुष्यों में उत्पन्न नहीं होते हैं, नैदानिक उपयोग10 के दौरान पूर्ववर्ती प्रतिरक्षा के जोखिम को कम करते हैं। इसलिए, शुद्धि विधियां जिन्हें किसी भी सीरोटाइप पर लागू किया जा सकता है, इन पुस्तकालयों के लिए रीढ़ के रूप में सेवा करने वाले कम सामान्यतः उपयोग किए जाने वाले सीरोटाइप के लिए सीरोटाइप-विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता को समाप्त करने के लिए आदर्श हैं।

Iodixanol घनत्व ढाल centrifugation उच्च संक्रामकता17 के साथ rAAV के उच्च टाइटर्स शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस प्रोटोकॉल में, आरएएवी के बड़े टाइटर्स का उत्पादन करने के लिए आवश्यक श्रम की मात्रा को कम करने के लिए निलंबन सेल संस्कृति में आरएएवी का उत्पादन किया जाता है। दूषित प्रोटीन की उपस्थिति को कम करने और वायरस वर्षा के जोखिम को कम करने के लिए सेल लाइसेट को साफ करने के लिए एक सेंट्रीफ्यूजेशन कदम भी शामिल है। यह प्रोटोकॉल पूर्व-नैदानिक उपयोग के लिए उपयुक्त उच्च शुद्धता आरएएवी की तैयारी का उत्पादन करने के लिए एक लागत प्रभावी तरीका है।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधान और बफ़र्स की संरचना तालिका 1में प्रदान की जाती है।

विलयन संयोजन
एएवी lysis बफर 5 M NaCl विलयन का 1.2 mL
1 एम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.5 समाधान के 2 एमएल
1 ड डहब्स2विलयन के 80 यूएल
एमक्यू पानी 40 एमएल
एएवी वर्षा समाधान 40 ग्राम खूंटी 8000
5 M NaCl विलयन का 50 mL
एमक्यू पानी 100 एमएल तक
15% आयोडिक्सानॉल अंश 7.5 एमएल OptiPrep
10X DPBS के 3 एमएल
5 M NaCl विलयन के 6 mL
1 M MgCl2 विलयन के 30 uL
एमक्यू से 30 एमएल
25% आयोडिक्सानॉल अंश 12. 5 एमएल OptiPrep
10X DPBS के 3 एमएल
1 M MgCl2 विलयन के 30 uL
60 यूएल फिनोल लाल समाधान
एमक्यू से 30 एमएल
40% आयोडिक्सानॉल अंश 33.3 एमएल OptiPrep
10X डीपीबीएस के 5 एमएल
1 एम डगसीएल2 विलयन के 50 यूएल
एमक्यू से 50 एमएल
60% आयोडिक्सानॉल अंश 50 एमएल OptiPrep
100 यूएल फिनोल लाल समाधान
एएवी बफर समाधान 5 एम एनसीएल के 8 एमएल
10% प्लुरोनिक एफ -68 का 20 यूएल
पीबीएस से 200 एमएल

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधानों के लिए समाधान रचनाएं।

1. Expi293 कोशिकाओं का ट्रिपल अभिकर्मक

  1. बीज Expi293 कोशिकाओं ( सामग्री की तालिकादेखें) 5 x 105 व्यवहार्य कोशिकाओं (vc)/एमएल के प्रारंभिक घनत्व पर।
  2. कोशिकाओं को 8% सीओ2 और 125 आरपीएम की एक प्रकार के बरतन गति के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक वे 3-5 एक्स 106 वीसी / एमएल के घनत्व तक पहुंचने की अनुमति दें। एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण का उपयोग करके सेल घनत्व और व्यवहार्यता की निगरानी करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  3. जब कोशिकाएं वांछित सेल घनत्व तक पहुंच जाती हैं, तो उन्हें ताजा मीडिया जोड़कर 1 से 10 में विभाजित करें ताकि उनकी कुल मात्रा उनकी मूल मात्रा का दस गुना हो। यदि आवश्यक हो, एक बड़ा कुप्पी में कोशिकाओं हस्तांतरण. इनक्यूबेशन पर लौटें।
  4. चरणों 1.2-1.3 में वर्णित कोशिकाओं का विस्तार करना जारी रखें जब तक कि वे 1 एल फ्लास्क में मीडिया के 250 एमएल में कम से कम 2 x 106 वीसी/एमएल के घनत्व तक न पहुंच जाएं।
  5. अभिकर्मक से पहले दिन, मीडिया के 250 एमएल में 2 x 106 वीसी/एमएल तक कोशिकाओं को पतला करें, आवश्यकतानुसार अतिरिक्त कोशिकाओं को त्याग दें। कोशिकाओं रात भर सेते हैं.
  6. अभिकर्मक के दिन, 18 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 58 x ग्राम पर कोशिकाओं का आधा अपकेंद्रित्र। ताजा माध्यम के एक ही मात्रा (125 एमएल) में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। सेल व्यवहार्यता 98% के करीब होनी चाहिए।
  7. दो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब तैयार करें। एक "पीईआई" और दूसरा "डीएनए" लेबल करें।
  8. पीईआई लेबल शंक्वाकार ट्यूब में, ऑप्टिमेम मीडिया में 12.5 एमएल की कुल मात्रा में पीईआई (पॉलीथीनमाइन, सामग्री की तालिकादेखें) के 1.2 एमएल को पतला करें।
  9. डीएनए लेबल शंक्वाकार ट्यूब में, OptiMEM मीडिया में 12.5 एमएल की कुल मात्रा में डीएनए के कुल 500 μg के लिए प्लाज्मिड डीएनए का एक समतुल्य समाधान तैयार करें।
  10. पीईआई समाधान के लिए डीएनए समाधान जोड़ें, अच्छी तरह से गठबंधन करने के लिए कई बार पलटना, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि डीएनए-पीईआई समाधान को पीईआई के लिए डीएनए के साथ चार्ज कॉम्प्लेक्स बनाने के लिए पूर्ण 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति है।
  11. डीएनए-पीईआई समाधान 10 मिनट के लिए ऊष्मायन के बाद, धीरे-धीरे Expi293 कोशिकाओं के लिए डीएनए-PEImax समाधान लागू करने के लिए एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। इनक्यूबेटर के लिए ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को लौटें और उन्हें 72 घंटे (चित्रा 1) के लिए सेते हैं.

Figure 1
चित्रा 1: अभिकर्मक के दो दिन बाद GFP व्यक्त Expi293 कोशिकाओं. GFP के लिए एक जीन युक्त एक प्लाज्मिड के साथ अभिकर्मक के बाद, Expi293 कोशिकाओं क्षणिक eGFP व्यक्त. कोशिका आकृति विज्ञान गोल है। छवि को 15 एमएस एक्सपोजर समय के साथ कैप्चर किया गया था। माइक्रोस्कोप छवियों को एपी-प्रतिदीप्ति रोशनी और 10x/0.30 उद्देश्य से लैस एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. आरएएवी वेक्टर शुद्धि

  1. 72 घंटे के बाद, निलंबन में कोशिकाओं को दो 250 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 415 x ग्राम पर स्पिन करें।
  2. सतह पर तैरनेवाला मीडिया को एक ताजा 500 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में डालें और बाद में प्रसंस्करण के लिए बर्फ पर 0 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. एएवी लाइसिस बफर (तालिका 1) के 10 एमएल में प्रत्येक सेल गोली को फिर से निलंबित करें। ट्यूबों में से एक में दो lysates एक साथ पूल. एएवी lysis बफर के एक अतिरिक्त 5 एमएल के साथ अन्य ट्यूब कुल्ला, तो यह पूल lysates के लिए जोड़ें. -70 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज।
    नोट: प्रयोग इस बिंदु पर रोका जा सकता है. सतह पर तैरनेवाला मीडिया को बर्फ के बजाय -70 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. चरण 2.2 से सतह पर तैरनेवाला मीडिया के लिए एएवी वर्षा समाधान की 1: 4 मात्रा जोड़ें। कम से कम 2 घंटे या रात भर के लिए बर्फ पर 0 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिश्रण और सेते हैं, कई बार पलटें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 3000 x ग्राम पर इनक्यूबेटेड समाधान को सेंट्रीफ्यूगेट करें।
  6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और एएवी lysis बफर के 5 एमएल में वायरल अवक्षेप युक्त गोली को फिर से निलंबित करें।
  7. एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल lysate पिघलना.
  8. सेल लाइसेट के साथ वायरल अवक्षेप को पूल करें। यह क्रूड लाइसेट है। सेंट्रीफ्यूजेशन ट्यूब को कुल्ला जिसमें वायरल अवक्षेप एएवी लाइसिस बफर के अतिरिक्त 5 एमएल और कच्चे लाइसेट के साथ पूल होता है।
  9. क्रूड लाइसेट को -70 डिग्री सेल्सियस तक फ्रीज करें, फिर 37 डिग्री सेल्सियस पर पिघलें। इस चक्र को एक बार फिर दोहराएं।
    नोट: कच्चे लाइसेट को पिघलना आवश्यक से अधिक समय तक 37 डिग्री सेल्सियस पर नहीं छोड़ा जाना चाहिए।
  10. एक बार तीसरी बार पिघलने के बाद, तुरंत कच्चे लाइसेट में बेंज़ोनेस के 4 माइक्रोन जोड़ें, मिश्रण करने के लिए पलटें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  11. 18 डिग्री सेल्सियस पर 650 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए कच्चे लाइसेट को सेंट्रीफ्यूगेट करें।
  12. सतह पर तैरनेवाला एक साफ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए स्थानांतरण. यह क्रूड वायरस है। गोली त्यागें।
  13. दूषित प्रोटीन को साफ करने के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर 3000 x ग्राम पर अतिरिक्त 30 मिनट के लिए कच्चे वायरस को सेंट्रीफ्यूगेट करें।
  14. सतह पर तैरनेवाला एक साफ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए स्थानांतरण. यह स्पष्ट वायरस है।
    नोट: प्रयोग इस बिंदु पर रोका जा सकता है. स्पष्ट वायरस को -70 डिग्री सेल्सियस तक फ्रीज करें।
  15. चार पेरिस्टाल्टिक ट्यूबों के साथ मल्टीचैनल पेरिस्टाल्टिक पंप सेट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)। प्रत्येक ट्यूब के दोनों सिरों पर केशिकाओं को संलग्न करें।
  16. विआयनीकृत पानी से भरे बीकर में पंप के इनपुट पक्ष पर केशिकाओं रखें। एक खाली बीकर में पंप के उत्पादन पक्ष पर केशिकाओं प्लेस. विआयनीकृत (डीआई) पानी के साथ टयूबिंग को फ्लश करने के लिए 25.0 आरपीएम पर पेरिस्टाल्टिक पंप चलाएं।
  17. जब अच्छी तरह से फ्लश किया जाता है, तो पंप चलाकर पेरिस्टाल्टिक टयूबिंग को खाली करें जब तक कि टयूबिंग केवल हवा से भर न जाए। एक साफ लिंट फ्री वाइप पर सभी केशिकाओं को बिछाएं।
  18. पंप के आउटपुट साइड पर एक रैक में चार अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब रखें।
  19. प्रत्येक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्पष्ट वायरस के 10 एमएल को सावधानीपूर्वक वितरित करने के लिए 10 एमएल सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करें। ध्यान रखें कि हवाई बुलबुले पेश न करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो प्रत्येक ट्यूब में स्पष्ट वायरस की मात्रा प्रति ट्यूब 12 एमएल तक बढ़ाया जा सकता है। नीचे चरण 2.25 में उचित रूप से 60% आयोडिक्सानॉल की मात्रा कम करें।
  20. स्पष्ट वायरस को आयोडिक्सानॉल अंशों (तालिका 1) के साथ निम्नतम घनत्व से पेरिस्टाल्टिक पंप का उपयोग करके उच्चतम घनत्व तक रेखांकित किया गया है। 15% अंश पहले जोड़ा जाता है, उसके बाद 25% अंश, 40% अंश और अंत में 60% अंश। एक साफ 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 15% आयोडिक्सानॉल अंश के 22 एमएल (5.5 एमएल प्रति अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब) स्थानांतरित करें। ट्यूब में पंप के इनपुट पक्ष पर केशिकाओं रखें, ध्यान रखें कि सभी केशिकाएं ट्यूब के नीचे छू रही हैं।
  21. पंप शुरू करें और टयूबिंग को आयोडिक्सानॉल अंश से भरने की अनुमति दें। जब आयोडिक्सानॉल अंश पंप के आउटपुट पक्ष पर केशिकाओं के सिरों तक पहुंचता है, तो पंप को बंद कर दें।
  22. स्पष्ट वायरस के साथ प्रत्येक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एक आउटपुट केशिका डालें, इस बात का ख्याल रखें कि केशिकाएं प्रत्येक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब के नीचे छू रही हैं।
    नोट: यह महत्वपूर्ण महत्व का है कि केशिकाओं में कोई हवा नहीं बची है। Iodixanol थोड़ा अलग दरों पर क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला टयूबिंग के माध्यम से प्रवाह कर सकते हैं, तो सुनिश्चित करें कि प्रत्येक व्यक्तिगत उत्पादन केशिका पूरी तरह से स्पष्ट वायरस में डालने से पहले iodixanol से भर जाता है. पंप को कई बार रोकना और शुरू करना आवश्यक हो सकता है।
  23. पंप शुरू करें और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को भरने दें। जब 15% अंश का अंतिम इनपुट केशिकाओं में लिया जाने वाला हो, तो पंप बंद कर दें। यह महत्वपूर्ण है कि कोई हवाई बुलबुले क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला टयूबिंग में प्रवेश.
    नोट: यदि हवा के बुलबुले इनपुट केशिकाओं में प्रवेश करते हैं, तो पंप को उन्हें वापस बाहर धकेलने के लिए उल्टी दिशा में संक्षेप में चलाया जा सकता है।
  24. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 25% आयोडिक्सानॉल अंश के 22 एमएल (5.5 एमएल प्रति अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब) स्थानांतरित करें। ध्यान रखें कि सभी केशिकाएं ट्यूब के नीचे छू रही हैं और पंप शुरू करें। जब 25% अंश का अंतिम इनपुट केशिकाओं में लिया जाने वाला हो, तो पंप बंद कर दें।
  25. 40% आयोडिक्सानॉल अंश के 20 एमएल (5 एमएल प्रति अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब) के साथ चरण 2.24 दोहराएं और फिर 60% अंश के 24 एमएल (6 एमएल प्रति अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब) के साथ।
  26. यदि अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में अभी भी खाली मात्रा बची है, तो 60% अंश को तब तक जोड़ना जारी रखें जब तक कि अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब पूरी तरह से तरल से भर न जाएं।
  27. प्रत्येक ट्यूब को तब तक भरें जब तक कि लाइसेट शीर्ष पर एक गुंबद न बना दे लेकिन ट्यूब से ओवरफ्लो न हो जाए। पंप बंद करो और ध्यान से प्रत्येक उत्पादन केशिका को हटा दें, ध्यान रखें कि आयोडिक्सानॉल ढाल को परेशान न करें।
  28. एक स्पेसर के साथ प्रत्येक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब को कैप करें और इसे टाइप 70 टीआई रोटर में लोड करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: सुनिश्चित करें कि रोटर उचित रूप से संतुलित है। उचित प्रशिक्षण के बिना अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज को संचालित करने का प्रयास न करें।
  29. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज में टाइप 70 टीआई रोटर लोड करें और 18 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 489,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूगेट करें।
  30. सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज से रोटर को उतारें। रोटर से प्रत्येक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब को सावधानीपूर्वक हटाने के लिए सुई नाक सरौता का उपयोग करें, ध्यान रखें कि आयोडिक्सानॉल ढाल को परेशान न करें।
  31. एक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब को सुरक्षित करने के लिए क्लैंप के साथ एक समर्थन रिंग स्टैंड का उपयोग करें।
  32. एक 5 एमएल सिरिंज के लिए एक 20 जीए सुई संलग्न करें और एक तरफ सेट. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब से टोपी को हटाने के लिए लिंट-फ्री वाइप का उपयोग करें।
  33. 40% -60% आयोडिक्सानोल इंटरफ़ेस(चित्रा 2)से लगभग 3 मिमी नीचे सुई के साथ अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब की दीवार में प्रवेश करें।
  34. धीरे-धीरे इंटरफ़ेस और 40% अंश का हिस्सा महाप्राण करें। लगभग 4 एमएल के कुल ड्रा के लिए, 40% अंश के शीर्ष को आकांक्षा करने से बचें।
  35. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब के खुले शीर्ष पर एक उंगली पकड़े हुए, सिरिंज को बाहर निकालें और एस्पिरेटेड एएवी अंश को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। एक तेज कंटेनर में सिरिंज त्यागें. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब को त्यागें।
  36. प्रत्येक अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए चरण 2.31-2.35 दोहराएं।
  37. एएवी लाइसिस बफर में एस्पिरेटेड एएवी अंश को लगभग दो गुना 40 एमएल की मात्रा में पतला करें।
  38. क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला टयूबिंग फ्लश के रूप में चरणों 2.16-2.17 में वर्णित है.
    नोट: प्रयोग इस बिंदु पर रोका जा सकता है. पतला एएवी अंश को रात भर 0 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  39. दो नए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में पतला एएवी अंश के प्रत्येक 20 एमएल लोड करें।
  40. आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के दूसरे दौर के लिए, पतला एएवी अंश को 40% अंश के केवल 10 एमएल (5 एमएल प्रति अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब) और 60% अंश के 14 एमएल (7 एमएल प्रति अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब) का उपयोग करके ऊपर वर्णित किया गया है। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन और आकांक्षा के लिए चरण 2.29-2.36 दोहराएं।
    नोट: क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और टयूबिंग भंडारण से पहले, कदम 2.16-2.17 में वर्णित के रूप में डि पानी के साथ टयूबिंग बाहर फ्लश.

Figure 2
चित्रा 2: 40% -60% आयोडिक्सानॉल इंटरफ़ेस लेबल के साथ Iodixanol ढाल। (ए) पहला आयोडिक्सानॉल ढाल। फिनोल लाल का उपयोग 40% आयोडिक्सानोल और 60% आयोडिक्सानोल अंशों में किया जाता है। यह दो अंशों के बीच पीएच में अंतर के कारण एक अलग रंग के रूप में दिखाई देता है। तीर इंगित करता है जहां सिरिंज को आरएएवी अंश की कटाई के लिए डाला जाना चाहिए, बस 40% -60% आयोडिक्सानॉल इंटरफ़ेस के नीचे। (बी) दूसरा आयोडिक्सानोल ढाल। इस चरण में केवल 40% और 60% आयोडिक्सानॉल अंशों का उपयोग किया जाता है। तीर इंगित करता है जहां सिरिंज rAAV अंश फसल के लिए डाला जाना चाहिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. बफर एक्सचेंज और वायरस एकाग्रता

  1. आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन के दूसरे दौर से एएवी अंश प्राप्त करने के बाद, इसे एएवी बफर समाधान के साथ दो गुना पतला करें।
  2. फिल्टर के शीर्ष पर एएवी बफर समाधान के 20 एमएल जोड़कर केन्द्रापसारक फिल्टर को संतुलित करें। 5 मिनट के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर 3000 x ग्राम पर तंत्र को सेंट्रीफ्यूगेट करें और प्रवाह को त्यागें।
  3. केन्द्रापसारक फिल्टर में पतला एएवी अंश जोड़ें। 5 मिनट के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर 3000 x ग्राम पर तंत्र को सेंट्रीफ्यूगेट करें और प्रवाह को त्यागें।
  4. फिल्टर के शीर्ष पर एएवी बफर समाधान के 20 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर 3000 x ग्राम पर तंत्र को सेंट्रीफ्यूगेट करें और प्रवाह को त्यागें।
    नोट: यदि केन्द्रापसारक फिल्टर झिल्ली अवरुद्ध हो जाती है, जिससे समाधान अक्षम रूप से प्रवाहित होता है, तो फिल्टर के शीर्ष में समाधान को ऊपर और नीचे खींचने के लिए P200 माइक्रोपिपेट का सावधानीपूर्वक उपयोग करें। माइक्रोपिपेट टिप के साथ फिल्टर को न छूने के लिए अत्यधिक सावधानी बरतें।
  5. 3.4 दो बार और दोहराएँ.
    नोट: सुनिश्चित करें कि फिल्टर के शीर्ष में कम से कम 1 एमएल वॉल्यूम बनाए रखकर एएवी अधिक केंद्रित नहीं है। ओवरकंसंट्रेशन को रोकने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन समय को समायोजित करना आवश्यक हो सकता है। यदि एएवी अधिक केंद्रित है, तो वर्षा हो सकती है।
  6. 1012 वीजी/एमएल की सीमा में एक अंतिम अनुमापांक के लिए, वायरस को लगभग 1 एमएल की अंतिम मात्रा में स्पिन करें।
    नोट: इस्तेमाल किया सीरोटाइप रीढ़ की हड्डी और वायरस की पैकेजिंग दक्षता के आधार पर, आप एक छोटी मात्रा में वायरस ध्यान केंद्रित करने के लिए पड़ सकता है.
  7. केन्द्रापसारक फिल्टर के शीर्ष से केंद्रित एएवी को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए p1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। एएवी बफर के 50 माइक्रोन के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर को धोने के लिए एक p200 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें ताकि किसी भी शेष वायरस को इकट्ठा किया जा सके और बाकी केंद्रित एएवी के साथ पूल किया जा सके।
  8. टिटरिंग के लिए केंद्रित एएवी के 2 माइक्रोन विभाज्य को अलग रखें। क्यूपीसीआर के लिए उपयोग किए जा सकने वाले आईटीआर प्राइमरों को देखने के लिए पूरक तालिका 1 देखें।
  9. इसे निष्फल करने के लिए 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से केंद्रित एएवी पास करें।
    नोट: जब एक छोटी मात्रा स्टरलाइज़ करना, वायरस के नुकसान को कम करने के लिए एक छोटे व्यास के साथ एक सिरिंज फिल्टर का चयन करने का ध्यान रखना। एक छोटे व्यास के कम प्रोटीन बाध्यकारी फिल्टर का उपयोग कम से कम वायरल नुकसान (डेटा नहीं दिखाया गया) में परिणाम होगा.
  10. निष्फल एएवी का उपयोग कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए तुरंत किया जा सकता है या चार सप्ताह के भीतर उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। इसे लंबी अवधि के भंडारण के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए।

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Representative Results

इस विधि का उपयोग एमएल प्रति कम से कम 1012 वायरल कणों के टाइटर्स प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। पूरक तालिका 1 में प्रदान किए गए आईटीआर प्राइमरों का उपयोग करके, डीडीपीसीआर द्वारा, या किसी अन्य अनुमापन विधि द्वारा क्यूपीसीआर द्वारा एक टिटर (चित्रा 3) प्राप्त किया जा सकता है। उप-इष्टतम टाइटर्स खराब पैकेजिंग दक्षता के साथ एक कैप्सिड एन्कोडिंग कैप जीन का उपयोग करने के परिणामस्वरूप हो सकते हैं।

उप-इष्टतम परिणामों का एक अन्य संभावित स्रोत Expi293 कोशिकाओं की खराब पारगमन दक्षता है। यह अभिकर्मक के दिन पर 3-4 x 106 vc/mL के घनत्व पर कोशिकाओं के लिए सिफारिश की है और सेल व्यवहार्यता 98% के करीब है कि. वर्तमान अध्ययन में, लेखकों ने इस प्रोटोकॉल के बाद 1.07 x 1012 वीजी का एक अनुमापांक प्राप्त किया। यह उपज पैकेजिंग AAVrh7418 से प्राप्त पिछली पैदावार के साथ संरेखित होती है।

Figure 3
चित्रा 3: qPCR द्वारा टिटर निर्धारण। वक्र 1 3.66 x 1011 vg/mL की मानक सांद्रता के साथ उत्पन्न हुआ था, वक्र 2 3.66 x 1010 vg/mL की मानक एकाग्रता के साथ उत्पन्न हुआ था, वक्र 3 अंतिम केंद्रित AAV नमूना था, वक्र 4 3.66 x 109 vg/mL की मानक एकाग्रता के साथ उत्पन्न हुआ था, और वक्र 5 3.66 x 108 vg/mL की मानक एकाग्रता के साथ उत्पन्न हुआ था। प्रत्येक qPCR प्रतिक्रिया डुप्लिकेट में किया गया था. (A) qPCR प्रवर्धन वक्र। मानकों को डीडीपीसीआर द्वारा शीर्षक दिए गए एएवी मानक के धारावाहिक कमजोर पड़ने से उत्पन्न किया गया था। undiluted मानक की एकाग्रता 3.66 x 1012 vg/mL थी। (बी) क्यूपीसीआर द्वारा उत्पन्न मानक वक्र। उत्पादित एएवी को 1.07 x 1012 वीजी की कुल उपज के लिए 5.75 एमएल में 1.85 x 1011 वीजी / एमएल की एकाग्रता के लिए निर्धारित किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 1: एएवी उल्टे टर्मिनल दोहराव (आईटीआर) के लिए आगे और रिवर्स प्राइमर अनुक्रम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

डबल आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल शुद्धि प्रोटोकॉल सार्वभौमिक विधि है क्योंकि यह किसी भी एएवी उत्परिवर्ती वेरिएंट पर लागू होता है, चाहे उनकी रिसेप्टर विशिष्टता कुछ भी हो। एएवी शुद्धि के प्रारंभिक तरीकों कण घनत्व पर निर्भर और CsCl और निरंतर सुक्रोज घनत्व ढाल centrifugation19 में isopycnic centrifugation शामिल है. बाद में, सीरोटाइप-विशिष्ट दृष्टिकोण विकसित किए गए, जिसने सेफरोज कॉलम20 से बंधे मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग किया। एक असंतुलित आयोडिक्सानोल ढाल का उपयोग कर एक उपन्यास घनत्व आधारित शुद्धि विधि 1999 में विकसित किया गया था और सीएससीएल ढाल21 से अलग उन लोगों की तुलना में उच्च संक्रामकता के साथ एएवी आइसोलेट्स उपज थी। एएवी को शुद्ध करने के तरीके 2000 के दशक की शुरुआत में विकसित होते रहे, क्योंकि कुछ समूहों ने 70%22,23,24से अधिक कच्चे लाइसेट से वसूली के साथ आरएएवी को शुद्ध करने के लिए उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग किया। इन विधियों अभी भी बड़े पैमाने पर विनिर्माण प्रक्रियाओं25 में उपयोग किया जाता है. एएवी को अलग करने के लिए क्रोमैटोग्राफी विधियों के विकास के बावजूद, आयोडिक्सानॉल घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्धि अभी भी व्यापक रूप से इसकी कम लागत और सीरोटाइप अज्ञेयवाद 26,27के कारण उपयोग की जाती है।

हालांकि यह विधि आरएएवी के समय-कुशल पूर्व-नैदानिक उत्पादन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, यह इसकी मापनीयता और सीजीएमपी विनिर्माण25 के लिए अनुकूलित होने की क्षमता में बहुत सीमित है। इस प्रकार, जैसा कि ऊपर वर्णित है, बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए अन्य शुद्धिकरण विधियों को प्राथमिकता दी जाती है। इसके अतिरिक्त, आरएएवी वैक्टर की ट्रांसजीन क्षमता सीमित है। एक एएवी जीनोम के लिए आकार सीमा जिसे बरकरार रखा जा सकता है, लगभग 5.2 केबी पाया गया है, अधिकतम ट्रांसजीन आकार 4.9 केबी के लिए, आईटीआर6 के लिए लेखांकन। यह प्रोटीन की अभिव्यक्ति को जटिल बनाता है जिसका सीडीएनए इस क्षमता से अधिक है। इन प्रोटीनों को ट्रांसजीन के संशोधन या विभाजन वेक्टर प्रणाली के उपयोग के बिना यहां वर्णित प्रणाली द्वारा व्यक्त नहीं किया जा सकता है। चेम्बरलेन एट अल 4.9 केबी28 से बड़े ट्रांसजीन को व्यक्त करने के लिए कई तरीकों का वर्णन करें।

यह विधि कैप्सिड सतह पर मौजूद उत्परिवर्तन के कारण विभिन्न जैव रासायनिक गुणों के साथ एएवी कैप्सिड युक्त उच्च-जटिलता वाले कॉम्बिनेटरियल कैप्सिड पुस्तकालयों के उत्पादन के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। यदि आरएएवी तैयारी जानवरों में इंजेक्शन के लिए नियत है, विशेष रूप से गैर-मानव प्राइमेट्स में, एंडोटॉक्सिन संदूषण को सीमित करना महत्वपूर्ण है। सभी चरणों के दौरान जीवाणु संदूषण को रोकने के लिए आरएएवी उत्पादन से जीवाणु संस्कृतियों को विकसित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले क्षेत्रों को अलग करने के लिए बहुत सावधानी बरतनी चाहिए। डिस्पोजेबल प्लास्टिकवेयर का उपयोग करके जैव सुरक्षा कैबिनेट में मानव कोशिकाओं और कच्चे एएवी के साथ सभी काम करें। यह बैक्टीरिया के संदूषण को रोकता है और एएवी के साथ काम करने के लिए एक आवश्यकता है, क्योंकि यह बीएसएल 1 एजेंट है।

यदि किसी प्रयोगशाला में शेकर के साथ CO2 इनक्यूबेटर तक पहुंच नहीं है, तो HEK293 कोशिकाओं के साथ पक्षपाती सेल संस्कृति का उपयोग Expi293 निलंबन सेल कल्चर के स्थान पर किया जा सकता है। सबकल्चरिंग के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें और क्रॉसन एट अल, 201817 में वर्णित अभिकर्मक प्रोटोकॉल का उपयोग करें।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम Expi293 अभिकर्मक, आयोडिक्सानोल ढाल की तैयारी, और AAV युक्त iodixanol अंश की आकांक्षा हैं। इनमें से किसी भी चरण के दौरान त्रुटियों के परिणामस्वरूप उप-इष्टतम rAAV पैदावार या rAAV उत्पन्न करने में विफलता हो सकती है।

Expi293 कोशिकाओं का अभिकर्मक इस प्रोटोकॉल का उपयोग rAAV के उत्पादन में एक महत्वपूर्ण कदम है. अभिकर्मक के दिन, कोशिकाओं ताजा मीडिया के आधे मात्रा में resuspended कर रहे हैं उन्हें अभिकर्मक29 से उबरने के लिए आवश्यक पोषक तत्वों के साथ प्रदान करने के लिए; अभिकर्मक कोशिकाओं के लिए एक बहुत ही कर प्रक्रिया है। हालांकि, वातानुकूलित मीडिया पूरी तरह से खारिज नहीं है क्योंकि यह वृद्धि कारक और सेल रखरखाव और विकास के लिए महत्वपूर्ण अन्य चयापचयों शामिल हैं. यह महत्वपूर्ण है कि पीईआई और डीएनए एक चार्ज कॉम्प्लेक्स30 बनाने के लिए कोशिकाओं पर लागू होने से पहले एक पूर्ण दस मिनट के लिए सेते हैं। पीईआई के साथ एक जटिल बनाने के बिना, डीएनए को कोशिकाओं द्वारा कुशलता से आगे नहीं बढ़ाया जाएगा।

आरएएवी का उत्पादन करते समय, मीडिया में पाए जाने वाले वायरस का अनुपात एक्सपीआई 293 सेल रिसेप्टर्स के साथ विशेष सीरोटाइप की बातचीत पर निर्भर करता है। कुछ सीरोटाइप अन्य31 की तुलना में उच्च दरों पर सेल मीडिया में जारी किए जाते हैं, यह आवश्यक है कि वायरल कणों को सेल मीडिया से अवक्षेपित किया जाए ताकि उच्चतम उपज को संभव बनाया जा सके और एक्सपीआई 293 सेल रिसेप्टर्स के लिए आत्मीयता की कमी के आधार पर किसी भी वेरिएंट के नुकसान को रोका जा सके। इसके विपरीत, सीरोटाइप एएवी 2 में 293 कोशिकाओं में मौजूद हेपरान सल्फेट प्रोटीओग्लाइकेन्स के साथ मजबूत रिसेप्टर इंटरैक्शन होता है, इसलिए मीडिया32 में बहुत कम पैक किए गए वायरस पाए जाते हैं। एएवी 2 के व्युत्पन्न का उत्पादन करते समय, खूंटी वर्षा चरण को छोड़ दें। वैकल्पिक सीरोटाइप के कॉम्बिनेटरियल कैप्सिड पुस्तकालयों या आरएएवी के उत्पादन के लिए, पीईजी के साथ वायरल कणों की वर्षा उपयुक्त है।

यह महत्वपूर्ण है कि अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान एकत्रित एएवी कणों को अलग करने के लिए 15% आयोडिक्सानॉल अंश में 1 एम सोडियम क्लोराइड मौजूद है। इस अंश में NaCl की चूक इस तरह के पारगमन दक्षता और immunogenicity33 में कमी के रूप में अवांछित परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. अंत में, आयोडिक्सानोल ढाल से एएवी की आकांक्षा में बहुत सावधानी बरतें। आयोडिक्सानॉल अंश के बहुत अधिक महाप्राण अंतिम उत्पाद17 में खाली कैप्सिड की उपस्थिति में परिणाम कर सकते हैं.

इस विधि का उपयोग कुछ मानव कोशिका प्रकारों के लिए उच्च ट्रोपिज्म के साथ कैप्सिड की पहचान करने के लिए डाउनस्ट्रीम-निर्देशित विकास प्रयोगों में उपयोग के लिए आरएएवी कॉम्बिनेटरियल कैप्सिड पुस्तकालयों को पैकेज करने के लिए किया जा सकता है। आरएएवी अल्पकालिक उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और दीर्घकालिक भंडारण34के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है। वर्तमान में, पुनः संयोजक एएवी पांच एफडीए अनुमोदित दवाओं ड्यूकेन पेशी dystrophy35,36,37 सहित शर्तों का इलाज में उपयोग में है. नैदानिक और पूर्व-नैदानिक परीक्षणों में कई अतिरिक्त आरएएवी उपचारहैं 38,39,40. इस वेक्टर पर आगे का शोध इस प्रकार अतिरिक्त जीन थेरेपी के विकास के लिए महत्वपूर्ण है।

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Disclosures

लेखकों के पास रिपोर्ट करने के लिए कोई खुलासा नहीं है।

Acknowledgments

कोई नहीं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5810 R benchtop centrifuge Eppendorf 22625501
8-channel peristaltic pump  Watson-Marlow 020.3708.00A
Automated cell counter  NanoEntek EVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifuge Beckman Coulter 369001
Benzonase Thermo Scientific 88701
Biological safety cabinet Labconco 322491101
CO2 incubator with shaker  Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubes Thermo Scientific 339652 50 mL
Conical centrifuge tubes Thermo Scientific 339650 15 mL
Disposable micro-pipets Fisherbrand 21-164-2G Capillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x) Sigma-Aldrich D1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope Nikon
Expi293 Expression Medium Gibco A1435101
Expi293F cells Gibco A14527
Filter tips USA Scientific 1126-7810 1000 µL
Filter tips USA Scientific 1120-8810 200 µL
Filter tips USA Scientific 1120-1810 20 µL
Filter tips USA Scientific 1121-3810 10 µL
Hypodermic needles Tyco Healthcare 820112 20 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lid VWR 10146-184
JS-5.3 rotor Beckman Coulter 368690
Magnesium chloride solution (1 M) Millipore Sigma M1028-100ML
Metal stand and clamp  Fisherbrand 05-769-6Q
Microcentrifuge tubes Eppendorf 22600028 1.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifuge Beckman Coulter A94471
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium Gibco 31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol) Serumwerk AXS-1114542 60% iodixanol solution
P1000 Pipet Gilson F144059M
P2 Pipet Gilson F144054M
P20 Pipet Gilson F144056M
P200 Pipet Gilson F144058M
Phenol red solution Sigma-Aldrich P0290
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4474
Pipet-Aid XP pipette controller Drummond Scientific 4-000-101
Plasmid pCapsid De novo or Addgene, etc.  N/A We used pACGrh74. 
Plasmid pHelper Addgene 112867
Plasmid pTransgene De novo or Addgene, etc.  N/A We used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%) Mp Biomedicals 92750049
Polyethylene glycol 8000 Research Products International P48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) Polysciences NC1038561 Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterile Corning 431123 500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterile Corning 430776 250 mL
Polypropylene Optiseal tubes Beckman Coulter 361625
Serological pipettes Alkali Scientific SP250-B 50 mL
Serological pipettes Alkali Scientific SP225-B 25 mL
Serological pipettes Alkali Scientific SP210-B 10 mL
Serological pipettes Alkali Scientific SP205-B 5 mL
Shaker flasks Fisherbrand PBV1000 1 L
Shaker flasks Fisherbrand PBV50-0 500 mL
Shaker flasks Fisherbrand PBV250 250 mL
Shaker flasks Fisherbrand PBV12-5 125 mL
Sodium chloride solution (5 M) Fisher Scientific NC1752640
Sterile syringes Fisherbrand 14-955-458 5 mL
Syringe filter Millipore SLGV013SL 0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M) Kd Medical RGE3363
Trypan blue solution Gibco 15250061
Tube rack assembly Beckman Coulter 361646
Tube spacers (x4) Beckman Coulter 361669
Tubing for peristaltic pump Fisher Scientific 14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor Beckman Coulter 337922
Ultra low temperature freezer Set at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentrator Sartorius VS2041
Water bath  Set at 37 °C

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References

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