Summary
Heri demonstrerer vi en tre-trins organoidmodel (todimensionel [2D] ekspansion, 2D-stimulering, tredimensionel [3D] modning), der tilbyder et lovende værktøj til senegrundforskning og en potentiel stilladsfri metode til senevævsteknik.
Abstract
Sener og ledbånd (T / L) er stærke hierarkisk organiserede strukturer, der forener muskuloskeletalsystemet. Disse væv har en strengt arrangeret kollagen type I-rig ekstracellulær matrix (ECM) og T / L-afstamningsceller hovedsageligt placeret i parallelle rækker. Efter skade kræver T / L lang tid til rehabilitering med høj fejlrisiko og ofte utilfredsstillende reparationsresultater. På trods af de seneste fremskridt inden for T / L biologiforskning er en af de resterende udfordringer, at T / L-feltet stadig mangler en standardiseret differentieringsprotokol, der er i stand til at rekapitulere T / L-dannelsesprocessen in vitro. For eksempel kræver knogle- og fedtdifferentiering af mesenkymale forløberceller kun standard todimensionel (2D) cellekultur og tilsætning af specifikke stimuleringsmedier. For differentiering til brusk er tredimensionel (3D) pelletkultur og tilskud af TGFß nødvendig. Imidlertid kræver celledifferentiering til sener en meget ordnet 3D-kulturmodel, som ideelt set også bør kunne udsættes for dynamisk mekanisk stimulering. Vi har etableret en 3-trins (ekspansion, stimulering og modning) organoidmodel til dannelse af en 3D-stanglignende struktur ud af et selvmonteret celleark, som leverer et naturligt mikromiljø med sine egne ECM-, autokrine- og parakrinefaktorer. Disse stanglignende organoider har en flerlags cellulær arkitektur inden for rig ECM og kan håndteres ganske let til eksponering for statisk mekanisk belastning. Her demonstrerede vi 3-trinsprotokollen ved hjælp af kommercielt tilgængelige dermale fibroblaster. Vi kunne vise, at denne celletype danner robuste og ECM-rigelige organoider. Den beskrevne procedure kan optimeres yderligere med hensyn til kulturmedier og optimeres mod dynamisk aksial mekanisk stimulering. På samme måde kan alternative cellekilder testes for deres potentiale til at danne T / L-organoider og dermed gennemgå T / L-differentiering. Alt i alt kan den etablerede 3D T / L organoid tilgang bruges som en model for senegrundforskning og endda til stilladsfri T / L-teknik.
Introduction
Sener og ledbånd (T / L) er vitale komponenter i muskuloskeletalsystemet, der giver væsentlig støtte og stabilitet til kroppen. På trods af deres kritiske rolle er disse bindevæv tilbøjelige til degeneration og skade, hvilket forårsager smerte og svækkelse af mobilitet1. Desuden kan deres begrænsede blodforsyning og langsomme helingskapacitet føre til kroniske skader, mens faktorer som aldring, gentagne bevægelser og forkert rehabilitering yderligere øger risikoen for degeneration og skade2. Konventionelle behandlinger, såsom hvile, fysioterapi og kirurgiske indgreb, er ikke i stand til fuldt ud at genoprette T / L-strukturen og funktionen. I løbet af de sidste par år har forskere stræbt efter bedre at forstå den indviklede karakter af T / L for at søge effektive behandlinger for T / L lidelser 3,4,5. T / L er kendetegnet ved en hierarkisk organiseret, ekstracellulær matrix (ECM) -domineret struktur, der primært består af type I kollagenfibre og proteoglycaner, en funktion, der er vanskelig at replikere in vitro6. Traditionelle todimensionelle (2D) cellekulturmodeller fanger ikke den karakteristiske tredimensionelle (3D) organisering af T / L-væv, hvilket begrænser deres translationelle potentiale samt hindrer de innovative fremskridt inden for T / L-regenerering.
For nylig har udviklingen af 3D-organoidmodeller givet nye muligheder for at fremme grundforskning og stilladsfri vævsteknik af forskellige vævstyper 7,8,9,10,11,12,13. For eksempel for at undersøge myotendinøs krydsning udviklede Larkin et al. 2006 3D-skeletmuskelkonstruktioner sammen med selvorganiserede senesegmenter afledt af rottehalesenen10. Desuden dirigerede Schiele et al. 2013 ved hjælp af mikrobearbejdede fibronectinbelagte vækstkanaler selvmontering af humane dermale fibroblaster til dannelse af cellulære fibre uden hjælp fra 3D-stillads, en tilgang, der kan fange nøgletræk ved embryonal seneudvikling11. I undersøgelsen af Florida et al. 2016 blev knoglemarvstromale celler først udvidet til knogle- og ligamentlinjer, der derefter blev brugt til at generere selvmonterede enkeltlagscelleark, som derefter blev implementeret for at skabe en multifasisk knogle-ligament-knoglekonstruktion, der efterligner det indfødte forreste korsbånd, en model, der sigter mod forbedret forståelse af ligamentregenerering12. For at belyse senemekanotransduktionsprocesser anvendte Mubyana et al. 2018 en stilladsfri metode, hvormed enkelte senefibre blev skabt og udsat for mekanisk belastningsprotokol13. Organoider er selvorganiserede 3D-strukturer, der efterligner vævets oprindelige arkitektur, mikromiljø og funktionalitet. 3D organoidkulturer giver en mere fysiologisk relevant model til at studere vævs- og organbiologi samt patofysiologi. Sådanne modeller kan også anvendes til at inducere vævsspecifik differentiering af forskellige stam-/stamcelletyper14,15. Derfor bliver implementering af 3D-organoidmodeller inden for T / L-biologi og vævsteknik en meget attraktiv tilgang 9,16. Alternative cellekilder kan implementeres til organoidsamlingen og stimuleres mod tenogen differentiering. En relevant celletype, der anvendes til demonstration i denne undersøgelse, er dermale fibroblaster 7,17,18. Disse celler er let tilgængelige gennem en hudbiopsiprocedure, som er mindre invasiv sammenlignet med knoglemarvspunktur eller fedtsugning og kan multipliceres ret hurtigt til store tal på grund af deres gode proliferative kapacitet. I modsætning hertil er mere specialiserede celletyper, såsom T / L-residente fibroblaster, mere udfordrende at isolere og udvide. Derfor blev dermale fibroblaster også anvendt som udgangspunkt for celleprogrammeringsteknologier til inducerede pluripotente embryonale stamceller19. At udsætte dermale fibroblaster for specifikke 3D-kulturbetingelser og signalsignaler, såsom transformering af vækstfaktor-beta 3 (TGFß3), som er rapporteret at fungere som en nøgleregulator for forskellige cellulære processer, herunder dannelse og vedligeholdelse af T/L, kan forstærke deres in vitro tenogene differentiering, hvilket fører til ekspression af senespecifikke gener og deponering af T/L-typisk ECM20, 21.
Her beskriver og demonstrerer vi en tidligere etableret og implementeret 3-trins (2D-ekspansion, 2D-stimulering og 3D-modning) organoidprotokol ved hjælp af kommercielt tilgængelige normale voksne humane dermale fibroblaster (NHDF'er) som cellekilde, der tilbyder en værdifuld model til undersøgelse af in vitro tenogenese7. På trods af at denne model ikke svarer til in vivo T / L-væv, giver den stadig et mere fysiologisk relevant system, der kan bruges til at undersøge cellulære differentieringsmekanismer, efterligne T / L patofysiologi in vitro og etablere T / L personlig medicin og lægemiddelscreeningsplatforme. Desuden kan undersøgelser i fremtiden evaluere, om 3D-organoiderne er egnede til stilladsfri T/L-konstruktion ved yderligere optimering samt anvendelige til udvikling af opskalerede mekanisk robuste konstruktioner, der ligner dimensionerne og strukturelle og biofysiske egenskaber af naturligt T/L-væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle trin skal udføres ved hjælp af aseptiske teknikker.
1. Kultur og præ-udvidelse af NHDF'er
- Kryohætteglasset, der indeholder voksne kryopræserverede normale humane dermale fibroblaster (NHDF'er, 1 x 106 celler) ved 37 °C, tøs hurtigt op, indtil de næsten optøes.
- Tilsæt langsomt 1 ml forvarmet fibroblastvækstmedium 2 (brugsklart sæt inklusive basalmedium, 2% føtalt kalveserum (FCS), basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) og insulin) suppleret med 1% penicillin / streptomycin (pen / strep) (NHDF-medium), forvarmet til 37 ° C til cellerne.
- Overfør cellerne til et 15 ml centrifugeglas. Centrifuger cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Supernatanten fjernes. Resuspender cellepellet i 12 ml forvarmet NHDF-medium.
- Overfør cellerne til en T-75-kolbe og ryst kort på tværs. T-75-kolben anbringes ved 37 °C i en 5% CO2 befugtet inkubator.
- Skift mediet hver 2. dag. Overhold NHDF'erne under et mikroskop, indtil de når 70% - 80% sammenløb.
2. 2D-udvidelse
- Tag T-75-kolben ud af inkubatoren og fjern NHDF-mediet. Cellerne vaskes med forvarmet fosfatbuffersaltvand (PBS).
- Tilsæt 3 ml 0,05% trypsin-EDTA til cellerne. Cellerne inkuberes ved 37 °C i en 5% CO2 befugtet inkubator, indtil cellerne løsner sig fra kolben (ca. 3 min).
- Tilsæt 6 ml forvarmet NHDF-medium for at neutralisere trypsinvirkningen. Overfør cellerne til et 15 ml centrifugeglas.
- Cellerne centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter ved RT, og supernatanten fjernes.
- Resuspender cellepellet i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) lav glukose suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1x MEM aminosyrer, 1% pen / strep, forvarmet ved 37 ° C.
- Pladerne af NHDF'erne i en 10 cm vedhængende cellekulturskål med en massefylde på 8 x 103 NHDF'er/cm2 (i alt 4,4 x 105 NHDF'er pr. 10 cm skål). Rokk forsigtigt på tværs.
- 10 cm cellekulturskålen anbringes ved 37 °C i en 5 % CO2 befugtet inkubator. Skift mediet hver 2. dag
- Overvåg cellerne under et mikroskop, indtil de når 100% sammenløb (ca. 5 dage).
3. 2D-stimulering
- Tag de 10 cm cellekulturskåle, der indeholder NHDF'erne (fra trin 2.6 og 2.7), ud af inkubatoren. Fjern dyrkningsmediet og vask cellerne med forvarmet PBS.
- Der tilsættes 10 ml DMEM-medium med højt glucoseindhold suppleret med 10% FBS, 50 μg/ml ascorbinsyre og 1% pen/strep, forvarmet ved 37 °C.
- Petriskålen anbringes ved 37 °C i en 5% CO2 befugtet atmosfære. Skift mediet hver 2. dag.
- Overvåg NHDF'erne under et mikroskop i 14 dage.
4. 3D modning
- Tag 10 cm cellekulturskålen ud af inkubatoren og fjern DMEM-mediet med høj glukose.
- Fjern forsigtigt og hurtigt det dannede celleark fra skålen med en celleskraber. Mens du løsner, skal du samtidig rulle cellearket ind i en 3D-stanglignende organoid.
- Tag NHDF-organoiderne op og læg dem i en 10 cm ikke-klæbende (til celler) petriskål. Denne skåltype bruges til at undgå celleudvandring fra organoid til plast.
- På dette tidspunkt eller en dag efter (dag 0 eller dag 1 af 3D-modning) skal du indsamle nogle af organoiderne til yderligere analyser såsom vådvægt, histologisk evaluering (dag 1-organoider foretrækkes, da de bliver mere kompakte), RNA- og proteinisolering.
- Fastgør organoidens kanter med metalstifter som følger:
- Hold forsigtigt den ene side af organoiden med en pincet, og med en anden pincet påføres forsigtigt manuel strækning med ca. 10% aksial forlængelse. For at estimere den 10% aksiale forlængelse skal du bruge en millimeter papir eller lineal.
- Tag derefter en metalstift op med pincetten og tryk manuelt ned gennem organoidkanten ind i plastskålen for at fastgøre den. Gentag denne procedure med den anden stift på organoidens anden kant.
- Tilsæt 10 ml DMEM højt glukosemedium suppleret med 10% FBS, 1x MEM aminosyrer, 50 μg / ml ascorbinsyre, 10 ng / ml TGFß3 og 1% pen / strep, forvarmet ved 37 ° C.
- Opvask på 10 cm ved 37 °C anbringes i en 5 % CO2 befugtet atmosfære. Skift mediet hver 2. dag.
- Overvåg organoiderne regelmæssigt i 14 dage.
BEMÆRK: Stifterne kan løsne sig og derfor fastgøres igen ved hjælp af samme teknik som beskrevet i trin 4.5. - Efter 14 dage fjernes DMEM-mediet med højt glukoseindhold fra organoiderne. Vask organoiderne med forvarmet PBS.
- Mål organoider for vådvægt på dag 0 og dag 14 ved hjælp af en præcisionsskala.
- Placer en tom 10 cm skål på skalaen og tare vægten til nul for at sikre, at kun vægten af organoiderne måles. Fjern kulturmediet helt fra 10 cm skålen og mål den organoide vådvægt en efter en.
BEMÆRK: I denne undersøgelse blev der på dag 0 vejet tre organoider pr. donor og på dag 14 to organoider pr. donor.
- Placer en tom 10 cm skål på skalaen og tare vægten til nul for at sikre, at kun vægten af organoiderne måles. Fjern kulturmediet helt fra 10 cm skålen og mål den organoide vådvægt en efter en.
- I henhold til undersøgelsens formål skal nogle af NHDF-organoiderne implementeres i yderligere histologiske analyser, eller de straks fryses ned i flydende nitrogen ved hjælp af sterile DNA/RNA-frie rør til efterfølgende DNA-, RNA- og proteinisolering og derefter opbevares ved -80 °C.
- Til histologisk undersøgelse fikseres hver organoid i 5 ml forkølet (4 °C) 4% paraformaldehyd i PBS (justeret til neutral pH) i 45 minutter på is efterfulgt af PBS-vask ved RT (2 x 5 minutter hver).
- Kryobeskyt de faste organoider ved hjælp af en saccharosegradient ved at placere organoiderne i glasbeholdere til histologi. Organoiderne inkuberes i 10 % saccharose i PBS-opløsning i 2 timer ved 4 °C, derefter 20 % saccharose/PBS i 2 timer ved 4 °C, og endelig inkubation med 30 % saccharose/PBS natten over ved 4 °C. Saccharoseopløsningerne ændres ved først at pipettere ud og derefter fylde den nye opløsning op.
- Integrer organoiderne i kryo-medium.
- Læg en kobberplade på tøris i en isoporkasse og køl ned i 10 min.
- Placer derefter en plastisk kryodom, fyldt med kryomedium, på kobberpladen og tryk forsigtigt organoiden til bunden af kryomolen ved hjælp af pincet. Vent, indtil kryomediet er helt frosset.
- For lange organoider skæres først i halve med en skalpel og sættes de to halvdele parallelt med hinanden i cryomold. Gentag proceduren for hver organoid, der er beregnet til at gennemgå histologisk analyse.
- Prøverne opbevares ved -20 °C indtil kryosektion.
- Brug et kryotoom til at skære organoiderne i længderetningen i 10 μm tykke sektioner og udsættes for histologisk farvning såsom hæmatoxylin og eosin (H&E) ved hjælp af standardprotokol8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D T/L organoidmodellen blev tidligere etableret og demonstreret her ved implementering af kommercielt indkøbt NHDF (n=3, 3 organoider pr. donor, NHDF blev brugt ved passager 5-8). Modelarbejdsgangen er opsummeret i figur 1. Figur 2 viser repræsentative fasekontrastbilleder af NHDF-kultur under præekspansion i T-75-kolber (figur 2A) samt i begyndelsen og efter 5 dages dyrkning i 2D-ekspansionstrinnet i 10 cm cellekulturskåle (figur 2B). Figur 2C (repræsentative fasekontrastbilleder) viser sammenløbet af NHDF'er under 2D-stimulering efter 14 dages dyrkning i 10 cm cellekulturskåle. Derefter blev cellepladerne manuelt løsrevet og samtidig rullet til 3D-stanglignende organoider (på dag 0 er organoidlængden ca. 6 cm, bredden ca. 0,4 cm), som blev dyrket under 10 % statisk spænding i 14 dage (figur 3, dag 0 og dag 14, repræsentative makroskopiske billeder). På dag 14 i 3D-modningsprocessen viste organoiderne et glinsende hvidt udseende, kontraherede og syntes tættere end de oprindelige organoider. Organoidernes våde vægt blev målt på dannelsestidspunktet (dag 0) og igen på dag 14 i 3D-modningstrinnet (figur 4). En signifikant reduktion i vådvægten blev observeret, hvilket indikerer sammentrækning og ECM strukturel reorganisering inden for organoiderne i løbet af tidsrummet for dette protokoltrin. Ud over vægtændring på grund af sammentrækningen reduceres organoidlængden også (på dag 14 er organoidlængden ca. 3,5 cm, og bredden er ca. 0,3 cm). I denne proces løsnede metalstifterne sig og måtte fastgøres igen; derfor anbefaler vi i løbet af de 14 dage med 3D-modning at overvåge organoiderne ofte. For at evaluere organoidernes morfologi blev langsgående sektioner opnået fra NHDF-organoider indsamlet på dag 1 og dag 14 i 3D-modningstrinnet og udsat for H&E-farvning (figur 5). På dag 1 viste organoiderne frakoblede lag, primært sammensat af celler omgivet af lave mængder ECM. Desuden var cellerne i organoidlagene ikke justeret langs den langsgående organoidakse, der blev brugt som retning for den påførte statiske trækbelastning. NHDF-kernerne udviste en rund form med varierende størrelser og former. H&E-analyse af dag 14-organoider afslørede en mærkbar stigning i eosinsignalet, hvilket indikerer ECM-aflejring under 3D-modningsprocessen. På dette tidspunkt udstillede organoiderne smeltede lag med områder indeholdende justerede celler. Celler var ofte i grupper; De blev dog også organiseret i cellerækker nogle steder. Størstedelen af kernerne havde lignende størrelser og var lejlighedsvis aflange.
Figur 1: Tegneserie af 3D T / L organoid model sammensat af 3 trin: 2D ekspansion, 2D stimulering og 3D modning. Oprindeligt blev NHDF'er forudvidet i en T-75-kolbe, indtil de nåede 70%-80% sammenløb. Derefter blev NHDF'er dyrket ved hjælp af Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) lavt glukosemedium i en 10 cm cellekulturskål i 5 dage (2D-ekspansion). Cellerne blev derefter stimuleret med DMEM højt glukosemedium suppleret med ascorbinsyre i 14 dages dyrkning (2D-stimulering). Derefter blev NHDF løsrevet fra den 10 cm klæbende skål, rullet ind i en 3D-stanglignende organoid, overført og fastgjort i en 10 cm ikke-klæbende cellekulturskål fyldt med DMEM-højglukosemedium suppleret med ascorbinsyre og transformerende vækstfaktor beta 3 (TGFß3) i 14 dage (3D-modning). De dannede 3D-organoider kan gennemgå en vurdering af vådvægt, histologisk evaluering, RNA- og proteinisolering og andre analyser (fx transmissionselektronmikroskopi, biomekaniske målinger) på forskellige tidspunkter såsom dag 0, 1 og 14. Tegneserien blev genereret i BioRender software. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Repræsentative fasekontrastbilleder af NHDF'er under præudvidelse, 2D-ekspansion og 2D-stimuleringstrin. A) NHDF'er under forekspansion i T-75-kolbe. B) NHDF'er på dag 1 og 5 i 2D-ekspansionstrinnet i en 10 cm cellekulturskål. (C) NHDF'er på dag 1 og 14 i 2D-stimuleringstrin i en 10 cm cellekulturskål. Skalastænger: 200 μm. Billeder blev taget med et omvendt mikroskop udstyret med et kamera med høj opløsning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Bruttomorfologi af NHDF 3D-organoider. Repræsentative makroskopiske billeder af NHDF-organoider på dag 0 og 14 i 3D-modningstrinnet. Vægtstang: 1 cm. Billeder blev taget med et mobiltelefonkamera. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Vådvægtsanalyse af NHDF 3D-organoider. Organoids vådvægtmåling var på dag 0 og dag 14, slutningen af 3D-modningsprocessen. Grafen viser middelværdier og standardafvigelser (NHDF n = 3, 3 organoider/donor på dag 0 og 2 organoider/donor på dag 14 på grund af 1 organoid/donor taget til histologi på dag 1), hver prik repræsenterer individuelle organoider, mens hver farvet form repræsenterer en anden individuel donor. Data præsenteres som gennemsnitlig ± standardafvigelse, og der blev anvendt en uparret parametrisk t-test. Statistiske forskelle: **p ≤0,01. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Histologisk analyse af NHDF 3D-organoider. Repræsentative billeder af hæmatoxylin og eosin (H&E) farvede sektioner af NHDF-organoider under 3D-modningsprocessen på dag 1 og 14. Højre billede - billeder med lav forstørrelse, venstre billede - forstørret visning med indikatorer som følger: gule pile - afbrudte lag; gule pilespidser - kerner med varierende størrelser og former; sorte pile - smeltede lag og ECM-aflejring; sorte pilespidser - cellerækker, kerner med tilsvarende størrelse og forlængelse; sorte stjerner -celler i grupper. Skalabjælker: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Resultaterne demonstreret i denne undersøgelse giver værdifuld indsigt i etablering og karakterisering af NHDF 3D organoid model til undersøgelse af T / L væv. 3-trinsprotokollen førte til dannelsen af 3D-stanglignende organoider, der udviser typiske træk ved T / L-niche. Denne model er tidligere omtalt i Kroner-Weigl et al. 20237 og demonstreret meget detaljeret her.
Fasekontrastbillederne vist i figur 2 viste progressionen af NHDF-sammenløbet og arkdannelsen under ekspansions- og stimuleringstrinnene. 3D-modningsprocessen blev udført ved manuelt at rulle cellearkene til 3D-stanglignende organoider, som derefter blev dyrket under statisk spænding i 14 dage. Organoiderne viste et glinsende hvidt udseende og øget tæthed på dag 14, hvilket tyder på sammentrækning og strukturel omorganisering inden for organoiderne. Dette indikerede, at modningstiden er afgørende for at opnå en mere organiseret og T / L vævsefterlignende struktur.
Desuden afslørede vægtanalyse et signifikant fald i organoidernes vådvægt mellem dag 0 og 14, hvilket igen indikerer signifikant sammentrækning og ECM-reorganisering inden for organoiderne under modningsprocessen. Det er vigtigt, at vådvægtmålinger kan variere mellem eksperimenter på grund af håndtering og restmedium i organoiden eller i skålene. Desuden kan organoiden indeholde mere medium i begyndelsen, fordi, som diskuteret nedenfor, på dag 0, er lagene dannet af cellearkvalsningen adskilt og ikke smeltet sammen. Med tiden sluttede lagene sig sammen og blev mere kompakte, og dermed kunne mediet ekstruderes.
Morfologisk evaluering ved H&E-farvning gav yderligere indsigt i de organoide strukturelle egenskaber. På dag 1 udviste organoiderne frakoblede lag, primært sammensat af celler med runde kerner omgivet af tynd pericellulær ECM. Manglen på cellejustering parallelt med trækbelastningens akse antydede, at yderligere modning er nødvendig for at opnå en mere organiseret cellulær og ECM-arkitektur af organoiderne. På trods af sammentrækningen og den organoide vægt- og dimensionsreduktion mellem dag 1 og 14 viste H&E-farvningen en stigning i eosinpositive områder, hvilket tyder på forstærket ECM-aflejring. Desuden var der ikke længere synlige lag, og lejlighedsvis havde cellerne aflange kerner og blev placeret i parallelle cellerækker. Dette påpegede, at cellerne i organoiderne gennemgår selvorganisering ved at ændre deres eget arrangement såvel som ECM-aflejring, struktur og justering og dermed efterligne adfærden af den oprindelige T / L-vævsdannelse.
Samlet set fremhæver disse resultater potentialet i NHDF-organoidmodellen som et værdifuldt værktøj til at studere T / L-biologi, in vitro tenogenese og endda til videreudvikling af stilladsfri T / L-teknik. Der er dog tre kritiske trin for en vellykket håndtering af 3D-organoidmodellen: 1) Dannelsen af et stramt celleark under protokollens 2D-stimuleringsfase. Ved anvendelse af primære celler afhænger dette overvejende af donorcelleegenskaberne; Det er derfor vigtigt at vurdere flere donorer parallelt; 2) Den manuelle rulning af cellearket. Dette kræver rullning hurtigt, men samtidig forsigtigt, cellearket ved hjælp af en celleskraber. Derfor er det tilrådeligt at planlægge indledende organoider til først at træne denne procedure; og 3) Den stabile fiksering af stifterne ved organoidkanterne. Denne fiksering sikrer den organoide aksiale forlængelse og forhindrer deformiteter samt kollapser i klumplignende struktur. Desuden kan stifterne pludselig løsne sig under 3D-modningsfasen, da organoiderne oplever ombygning af ECM, derfor er det vigtigt ofte at overvåge hver organoid og fastgøre stifterne igen.
Den nuværende model har endnu ikke nået niveauet for in vivo-efterligning til T / L-væv og har en række begrænsninger. For eksempel kræver det et stort antal celler pr. Organoid samt 35 dage for proceduren, der skal afsluttes, mens de fleste differentieringsprotokoller, såsom 3D chondrogenic pelletmodel, er indstillet til 21 dage22. Vasketrinnene i protokolproceduren bør fortrinsvis udføres med fysiologisk afbalanceret vaskebuffer, f.eks. Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) eller Earles Balanced Salt Solution (EBSS), snarere end PBS, som kan have metaboliske konsekvenser for primære humane celler dyrket in vitro. Med hensyn til kulturmediet, der anvendes i 2D-stimulerings- og 3D-modningsstadierne i organoiden, er det blevet valgt DMEM plus 10% FBS-formulering, fordi sådan er grundlaget for bredt accepterede differentieringsprotokoller såvel som med den hensigt at standardisere og sammenligne mellem forskellige celletyper for deres organoidogene egenskaber23. Reproduktion af 3-trins organoidprotokollen på tværs af forskellige laboratorieindstillinger kan påvirkes af den anvendte celletype, cellekvalitet og passage samt donorafhængige celleegenskaber. Variationer i udstyret, især i kvaliteten af de 10 cm cellekulturskåle24 , der anvendes under 2D-stimuleringsfasen, kan potentielt påvirke robustheden af cellearkdannelsen. På grund af ECM-sammentrækning over 3D-modningen kan den aksiale fiksering af organoiderne via stifter løsne sig; Derfor anbefales hyppig overvågning som nævnt ovenfor. Test og valg af forskellige stifter med hensyn til diameter og styrke kan også reducere risikoen for stiftløsrivelse25. Brug af stifter til manuel strækning er imidlertid ikke robust, og det er tilbøjeligt til at håndtere variation; Derfor er det meget vigtigt at udvikle i opfølgningsforskning en klemmekanisme til at holde de organoide kanter, hvilket ikke kun kan resultere i standardisering af dette trin, men også kan tillade dynamisk strækning af organoiderne. Generelt vil det være af interesse at undersøge to måder at modificere organoidmodeller på, en nedskalering - at reducere antallet af celler pr. organoid og proceduretid og dermed gøre det mere brugervenligt, især til in vitro-undersøgelser ; og den anden opskalering - for at øge organoidernes dimensioner for at teste deres adfærd i store dyremodeller som potentiel seneudskiftningsstrategi.
Den her demonstrerede model kan give en platform for at undersøge mekanismerne bag seneudvikling, patofysiologi og måske reparation og regenerering, hvis organoiderne kombineres med forskellige celletyper og udsættes for mikrorupturer. Det er vigtigt at nævne, at undersøgelsen af Kroner-Weigl et al. 20237 identificerede flere begrænsninger med hensyn til NHDF-celletypen, nemlig at de NHDF'er, der dannes, er større og mere cellulære end dem, der stammer fra T/L-celler, hvilket gør det udfordrende at kontrollere celleproliferation og adfærd. Med hensyn til celleapoptose viste terminal deoxynukleotidyltransferase dUTP nick end labeling (TUNEL) -baseret analyse ingen tegn på døde celler i hele organoiden på dag 147, hvilket tyder på passende diffusion af næringsstoffer, affald og ilt under 3D-modningstrinnet. Interessant nok, på trods af de morfologiske forskelle, foreslog pilotscreening ved kvantitativ PCR af en række T / L-relaterede gener (herunder forskellige kollagentyper, Scleraxis (SCX), Mohawk (MKX) osv.) sammenlignelig genekspression mellem NHDF og T / L-organoider7, et fund, der bør undersøges yderligere såvel som bør valideres på proteinniveau. Derfor kræves der yderligere optimering for denne celletype for at understøtte T / L-differentiering og kan baseres på justering af mediet, der anvendes i 2D-stimulering og 3D-modningstrin (f.eks. Serumkoncentration, vækstfaktorer, vitaminer), forlængelse af modningstiden eller endda udsættelse af organoiderne for dynamisk mekanisk strækning. Udvikling af protokollen kunne yderligere forbedre de organoide sammensætningsmæssige, strukturelle og funktionelle egenskaber, hvilket gør det muligt for modellen bedre at efterligne den komplekse in vivo T / L-vævsniche. Desuden kan alternative cellekilder undersøges for deres evne til at danne T / L-organoider, og om de kan gennemgå T / L-differentiering. Yan et al. 20209, anvendte 3D-organoidmodellen ved at bruge unge / sunde og alderen / degenerative senestamceller / stamceller (Y-TSPC'er og A-TSPC'er) til at undersøge cellulær adfærd i 3D samt om senedannende kapacitet ændres med T / L-aldring. De rapporterede, at A-TSPC 3D-organoider udviser dårlig vævsmorfologi, og cellerne indeni har en lavere spredningshastighed, men højere apoptose parallelt med forhøjede niveauer af ældningsrelaterede markører9. Derfor er T / L 3D-organoidmodellen en lovende platform til at studere molekylære og cellulære mekanismer involveret i senens aldring og kan yderligere bruges til at teste nye farmakologiske terapier til senreparation og regenerering. I en anden tilgang implementerede Chu et al. 2021 tandfollikelceller (DFC'er) i 3D-organoidmodellen for at vurdere deres ligamentogene differentiering. Denne celletype dannede meget velorganiserede organoider, hvilket tyder på DFC'er som en attraktiv cellekilde til at differentiere i periodontal ligament (PDL) væv, hvilket igen kunne udvikle en lovende terapeutisk strategi for parodontitis8.
I fremtiden kan modellen blive endnu mere kompleks ved at inkludere forskellige celletyper (fx myofibroblaster, makrofager), som kan give ny indsigt i cellespecifik adfærd og cellulær krydstale inden for organoider og bidrage til en mere omfattende forståelse af T / L biologi, fysiologi og patofysiologi 8,9,16,26.
3D-organoidmodellerne har flere fordele til vævsteknik og regenerativ medicin. De efterligner nøje den cellulære sammensætning og organisation samt celle-til-celle og celle-til-matrix interaktioner af humant væv og tilbyder derved en fysiologisk relevant platform til at studere sygdomsmekanismer og lægemiddelresponser27. Organoider kan bruges som en screeningsplatform med høj kapacitet til at vurdere effektiviteten, men også potentielle bivirkninger af forskellige lægemidler og give et pålideligt og billigt alternativ til dyreforsøg. Desuden muliggør de direkte sammenligninger mellem raske og syge tilstande, hvilket muliggør opdagelse af vigtige molekylære og cellulære ændringer forbundet med forskellige patologier, identifikation af biomarkører til tidlig sygdomspåvisning samt facilitering af stigende forståelse af sygdomsmekanismer og udvikling af målrettede terapier28,29.
Samlet set demonstrerede vi meget detaljeret trinene i den tidligere etablerede 3D T / L organoidmodel, der giver en lovende platform til at studere T / L vævsbiologi og in vitro tenogene processer af forskellige celletyper. Yderligere implementering, optimering og forskning af denne model opfordres kraftigt, da de kan føre til fremme af stilladsfri T / L-ingeniørstrategier, som igen kan bidrage til at forbedre T / L-terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
D.D. og S.M.-D. anerkende BMBF-bevillingen "CellWiTaL: Reproducerbare cellesystemer til lægemiddelforskning - overførselslagfri laserudskrivning af meget specifikke enkeltceller i tredimensionelle cellulære strukturer" Forslag nr. 13N15874. D.D. og V.R.A. anerkender EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS "Holistisk træning af næste generations slidgigtforskning" GA Nr. 101034412. Alle forfattere anerkender fru Beate Geyer for teknisk assistance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | A8960 | |
| 10 cm adherent cell culture dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430167 | |
| 10 cm non-adherent petri dish | Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany | CLS430591 | |
| Cryo-medium | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4583 | |
| Cryomold standard | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands | 4557 | |
| D(+)-Sucrose | AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany | A2211 | |
| DMEM high glucose medium | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-HA | |
| DMEM low glucose | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | DMEM-LPXA | |
| Fetal bovine serum | Anprotec, Bruckberg, Germany | AC-SM-0027 | |
| Fibroblast growth medium 2 | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-23020 | |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | |
| Inverted microscope with high resolution camera | Zeiss | NA | Zeiss Axio Observer with Axiocam 506 |
| MEM amino acids | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | NEAA-B | |
| Metal pins | EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic | 04.31 | |
| Normal human dermal fibroblasts | PromoCell, Heidelberg, Germany | C-12302 | |
| Paraformaldehyde | AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | A3813 | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany | 15140122 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | P4417 | |
| TGFß3 | R&D Systems, Wiesbaden, Germany | 8420-B3 | |
| Trypsin-EDTA 0,05% DPBS | Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany | TRY-1B |
References
- Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
- Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
- Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
- Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
- Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
- Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H.
- Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
- Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
- Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
- Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
- Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
- Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
- Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
- Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
- Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
- Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
- Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
- Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
- Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
- Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
- Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
- Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
- Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
- Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
- Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
- Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
- Hofer, M., Lutolf, M. P.
- Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
