تحسين بروتوكول للتسليخ مجهري ليزر من الجزر البنكرياسية الإنسان من عينات جراحية
Summary
تسليخ مجهري بالليزر هو الاسلوب الذي يسمح للانتعاش الخلايا المحددة من كميات ضئيلة من حمة. نحن هنا وصف بروتوكول للحصول على الجزر البنكرياسية الإنسان من العينات الجراحية لاستخدامها في الدراسات transcriptomic. لدينا بروتوكول يحسن تألق ذاتي لا يتجزأ من خلايا بيتا الإنسان، مما يسهل تحصيلها.
Abstract
تسليخ مجهري ليزر (LMD) هو الاسلوب الذي يسمح للانتعاش الخلايا المحددة والأنسجة من كميات ضئيلة من 1،2 حمة. ويمكن استخدام الخلايا تشريح لمجموعة متنوعة من التحقيقات، مثل الدراسات transcriptomic أو البروتين، وتقييم أو تحليل الحمض النووي الصبغي 2،3. تطبيق الصعبة وخاصة من LMD هو التحليل transcriptome، والتي، نظرا لعطوبية من RNA 4، يمكن أن تكون بارزة بشكل خاص عندما يتم تشريح الخلايا من الأنسجة التي هي غنية من RNases، مثل البنكرياس. بروتوكول تسليخ مجهري التي تمكن تحديد سريع وجمع الخلايا المستهدفة من الضروري في هذا الإطار من أجل اختصار الوقت التعامل مع الأنسجة، وبالتالي، لضمان الحفاظ على RNA.
نحن هنا وصف بروتوكول للحصول على خلايا بيتا في البنكرياس الإنسان من العينات الجراحية لاستخدامها في الدراسات transcriptomic 5. قطع صغيرة من البنكرياس من حوالي 0،5-1 جوقطعت م 3 من هوامش صحية تظهر العينات البنكرياس مقطوعة، جزءا لا يتجزأ من نسيج تك في مجمع OCT، تجميد فورا في المبرد 2-Methylbutane، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تقطيع. وقطعت أربعين أقسام المسلسل من سمك ميكرومتر 10 على ناظم البرد تحت الإعداد -20 درجة مئوية، بشكل فردي لنقل الشرائح الزجاجية، والمجففة داخل ناظم البرد لمدة 1-2 دقيقة، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
مباشرة قبل الإجراء الليزر تسليخ مجهري، تم إصلاحها في أقسام الجليد الباردة، الطازجة الإيثانول 70٪ لمدة 30 ثانية، وغسلها من قبل 5-6 الانخفاضات في الماء المثلج DEPC المعالجة الباردة، والمجففة بواسطة حضانات دقيقة واحدة اثنين في الجليد٪ 100 الباردة ثم الإيثانول من الزيلين (والذي يستخدم لجفاف الأنسجة) لمدة 4 دقائق، ثم كانت المقاطع النسيجية الهواء المجفف بعد ذلك لمدة 3-5 دقيقة. الأهم من ذلك، جميع الخطوات، ما عدا الحضانة في الزيلين، وأجريت باستخدام الكواشف الجليد الباردة – على تعديل أكثر من بروتوكول موضح سابقا 6. التحريرأدى ilization من الكواشف الجليد الباردة في زيادة واضحة في تألق ذاتي لا يتجزأ من خلايا بيتا، وتسهيل الاعتراف بها. لتسليخ مجهري، وكانت أربعة أقسام المجففة في كل مرة: وضعت اثنين في أنبوب احباط الملفوفة 50 مل، لحماية الأنسجة من الرطوبة وتبييض، وتم على الفور microdissected المتبقيتين. تم تنفيذ هذا الإجراء باستخدام أداة MicroBeam PALM (زايس) توظيف الضغط ليزر السيارات القذف (AutoLPC) واسطة. الانتهاء من خلايا بيتا / تشريح جزيرة من أربع cryosections لم تعد مطلوبة من 40-60 دقيقة. تم جمع الخلايا في واحدة AdhesiveCap و lysed مع 10 ميكرولتر العازلة تحلل. تم الحصول على عينة الحمض النووي الريبي كل واحد لتحليل عينات transcriptomic من خلال الجمع بين الخلية 10 microdissected، تليها استخراج الحمض النووي الريبي باستخدام بيكو الصرفة RNA عزل كيت (السماك الرامح). إن هذا البروتوكول يعزز تألق ذاتي لا يتجزأ من خلايا بيتا الإنسان، مما يسهل الاعتراف بها سريعة ودقيقة وجollection. يمكن زيادة تحسين هذا الإجراء تمكين تشريح خلايا بيتا مختلفة ظاهريا، مع الآثار المحتملة لتحسين فهم التغيرات المرتبطة بمرض السكري من النوع 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
وصفنا نهج يمكن الاعتماد عليها ليزر تسليخ مجهري (LMD) من عينة من الجزر البنكرياسية الإنسان الجراحية. شريطة أن يكون المجهر LMD متاح، يمكن تنفيذ هذا الإجراء في أي مؤسسة بحثية أداء pancreatectomies جزئية، وبالتالي زيادة فرص الحصول على المواد من كلا جزيرة البشرية مواضيع 2 غير السكري …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نريد ان نشكر جميع زملائنا الذين قدموا المساعدة والمشورة ومدخلا حاسما في الخطوات المختلفة لهذا المشروع. وأيد إنتاج هذه المادة مع الفيديو الأموال من IMIDIA ( http://www.imidia.org )، وزارة البيئة الألمانية للتعليم والبحث (BMBF) للمركز الألماني لأبحاث مرض السكري (DZD، http://www.dzd ev.de- ) ومستشفى جامعة كارل غوستاف كاروس في جامعة دريسدن التقنية. تلقت العمل مما يؤدي إلى هذا المنشور بدعم من مبادرة مبتكرة التعهد الأدوية المشتركة في إطار اتفاقية المنحة رقم 155005 (IMIDIA)، والموارد التي تتكون من مساهمة مالية من برنامج الاتحاد الأوروبي الإطاري السابع (FP7/2007-2013) وEFPIA الشركات المساهمة في النوع.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22×22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
- Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).
