Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici
Summary
Microdissezione laser è una tecnica che consente il recupero di cellule scelte da piccole quantità di parenchima. Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici da utilizzare per gli studi di trascrittomica. Il nostro protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro collezione.
Abstract
Microdissezione laser (LMD) è una tecnica che consente il recupero di cellule e tessuti selezionati da piccole quantità di parenchima 1,2. Le cellule sezionato possono essere utilizzati per una varietà di indagini, come gli studi di proteomica, trascrittomica o di valutazione o analisi del DNA cromosomico 2,3. Un'applicazione particolarmente impegnativa LMD è l'analisi del trascrittoma, che, a causa della instabilità del RNA 4, può essere particolarmente importante quando le cellule vengono sezionati da tessuti che sono ricchi di RNasi, come il pancreas. Un protocollo microdissezione che consente una rapida identificazione e raccolta delle cellule bersaglio è essenziale in questa impostazione per abbreviare il tempo di movimentazione del tessuto e, di conseguenza, per garantire la conservazione dell'RNA.
Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di cellule beta pancreatiche da campioni chirurgici di essere utilizzati per lo studio trascrittomica 5. Piccoli pezzi di pancreas di circa 0,5-1 cm 3 sono stati tagliati dai margini sani figuranti di campioni resecati pancreas, incorporati in Tissue-Tek Compound ottobre, immediatamente congelati in refrigerata 2-metilbutano, e conservati a -80 ° C fino al sezionamento. Quaranta sezioni seriali di spessore 10 um sono state tagliate su un criostato in un ambiente -20 ° C, trasferite individualmente i vetrini, essiccate all'interno del criostato per 1-2 min, e conservati a -80 ° C.
Immediatamente prima della procedura microdissezione laser, le sezioni sono state fissate in ghiaccio freddo, preparata etanolo al 70% per 30 sec, lavato da 5-6 cali di ghiaccio freddo acqua trattata con DEPC, e disidratato per un minuto due incubazioni in ghiaccio freddo 100% etanolo seguita da xilene (che viene usato per la disidratazione del tessuto) per 4 min, sezioni di tessuto sono state poi essiccate dopo per 3-5 min. È importante sottolineare che tutti i passi, eccetto l'incubazione in xilene, sono stati eseguiti utilizzando ghiacciata reagenti – una modifica su un protocollo precedentemente descritto 6. Utilization di reagenti ghiaccio freddo ha determinato un aumento marcato della autofluorescenza intrinseca delle cellule beta, e facilitato il loro riconoscimento. Per microdissezione, quattro sezioni erano disidratati ogni volta: due sono stati posti in una pellicola protettiva tubo da 50 ml, per proteggere i tessuti da umidità e sbiancamento, gli altri due sono stati immediatamente microdissezione. Questa procedura è stata eseguita utilizzando un PALM MicroBeam strumento (Zeiss) che impiega il laser a pressione Auto catapultando (AutoLPC) modalità. Il completamento di cellule beta / dissezione isolotto da quattro criosezioni necessari non più di 40-60 min. Le cellule sono state raccolte in un unico AdhesiveCap e lisate con 10 microlitri di tampone di lisi. Ogni singolo campione di RNA per analisi trascrittomica stata ottenuta combinando 10 campioni cellulari microdissezione, seguita da estrazione RNA utilizzando il Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Questo protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro rilevazione rapida e precisa e Collezione. Ulteriore miglioramento di questa procedura potrebbe consentire la dissezione delle cellule beta fenotipicamente diversi, con possibili implicazioni per una migliore comprensione dei cambiamenti associati al diabete di tipo 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo un metodo affidabile per la microdissezione laser (LMD) di isole umane da un campione del pancreas chirurgico. A condizione che un microscopio LMD è disponibile, questa procedura potrebbe essere attuata in qualsiasi istituto di ricerca di eseguire pancreatectomies parziali, aumentando in tal modo l'accesso al materiale umano da entrambe le isole non-diabetici e di tipo 2 soggetti diabetici. Questo è particolarmente rilevante data la scarsità di pancreas offerto per l'isolamento delle isole. Aspett…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vogliamo ringraziare tutti i colleghi che hanno fornito aiuto, consiglio e contribuisce in modo fondamentale a vari passi di questo progetto. La produzione di questo articolo video è stato sostenuto con i fondi IMIDIA ( http://www.imidia.org ), il Ministero tedesco dell'Istruzione e della ricerca (BMBF) al Centro tedesco per la ricerca del diabete (DZD, http://www.dzd -ev.de ) e l'Ospedale universitario Carl Gustav Carus presso l'Università di Tecnologia di Dresda. Il lavoro ha portato a questa pubblicazione ha ricevuto il sostegno della iniziativa medicinali innovativi impresa comune ai sensi della convenzione di sovvenzione n ° 155005 (IMIDIA), le risorse di cui sono composte di partecipazione finanziaria del Settimo programma quadro dell'Unione europea (FP7/2007-2013) e dall'EFPIA società 'contributo di natura.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22×22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
- Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).
