수술 표본에서 인간 췌장 섬의 레이저 Microdissection을위한 개선 된 프로토콜
Summary
레이저 microdissection은 실질의 미세한에서 선택한 셀의 복구를 할 수있는 기술입니다. 여기 transcriptomic 연구에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 섬을 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 우리 프로토콜은 따라서 자신의 컬렉션을 촉진 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상시킵니다.
Abstract
레이저 microdissection (LMD)는 실질 1,2의 미세한에서 선택한 셀과 조직의 복구를 할 수있는 기술입니다. 해부 세포는 이러한 transcriptomic 또는 proteomic 연구, DNA 평가 나 염색체 분석 2,3 등 조사의 다양한 사용할 수 있습니다. LMD의 특히 어려운 응용 프로그램은 RNA (4)의 lability로 인해 셀이 같은 췌장 등의 RNases의 풍부 조직 분석하던 때 특히 눈에 띄는 될 수 transcriptome 분석이다. 대상 세포의 빠른 식별 및 수집을 가능하게 microdissection 프로토콜은 조직 처리 시간을 단축 할 수 있으며, 결과적으로, RNA의 보존을 보장하기 위해이 설정에 필수적입니다.
여기 transcriptomic 연구 5에 사용되는 수술 표본에서 인간의 췌장 베타 세포를 획득을위한 프로토콜을 설명합니다. 0.5-1에 대한 C의 췌장의 작은 조각m 3 sectioning 때까지 즉시 2 Methylbutane 차가운에 냉동 조직 – 테크 10월 컴파운드에 포함 resected의 췌장의 표본의 건강 나타나는 여백,에서 절단하고, -80에 저장 ° C 있었다. 10 μm 두께의 40 시리얼 섹션은 1-2 분의 그라 이오 스탯 내부 건조하고, -80에 저장 유리 슬라이드, ° C.에 개별적으로 전송, -20 ° C 설정에 따라 그라 이오 스탯을 삭감했다
즉시 레이저 microdissection 절차 전에 섹션은 얼음 차가운 백퍼센트에서 두 1 분 incubations하여 얼음처럼 차가워에서 수정 갓 30 초에 70 %의 에탄올을 준비, 얼음 차가운 DEPC – 처리 물에 5-6 딥으로 세척하고, 건조 된 에탄올은 4 분 동안 크실렌 (조직 탈수에 사용되는)에 의해 다음, 조직 섹션 3-5 분 동안 나중에 한 후 공기 건조했다. 중요한 것은, 모든 단계는 크실렌의 부화를 제외하고 얼음처럼 차가운 시약을 사용하여 수행되었습니다 – 이전에 설명 된 프로토콜을 6 이상 수정. UT얼음 차가운 시약의 ilization는 베타 세포의 고유 autofluorescence의 발음 증가로 이어진, 그들의 인정을 촉진. microdissection를 들어, 4 개의 섹션은 각 시간 건조했다 : 두 수분과 표백에서 조직을 보호하기 위해 호일로 싼 50 ML 튜브에 배치 된, 나머지 두 사람은 즉시 microdissected되었습니다. 이 절차는 (AutoLPC) 모드를 Catapulting 자동 레이저 압력을 채용 PALM MicroBeam 악기 (Zeiss)를 사용하여 수행되었습니다. 40-60 분보다 더 이상 필요 넷 cryosections에서 베타 세포 / 작은 섬의 해부의 완성. 셀은 한 AdhesiveCap으로 수집, 10 μl 용해 버퍼로 lysed되었습니다. transcriptomic 분석을 위해 각 단일 RNA 시료는 10 셀 microdissected 샘플, 피코 순수 RNA 절연 키트 (악튜러스)를 사용하여 RNA 추출 다음을 조합하여 얻은 것입니다. 이 프로토콜은 따라서 자신의 신속하고 정확한 인식과 C을 촉진, 인간의 베타 세포의 고유 autofluorescence을 향상ollection. 이 절차의 추가 개선 2 형 당뇨병과 관련된 변경 사항을보다 잘 이해 가능한 의미와 함께, phenotypically 다른 베타 세포의 절개를 사용하도록 설정할 수도 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 수술 췌장 표본의 인간 섬의 레이저 microdissection (LMD)에 대한 신뢰할 수있는 접근 방법을 설명합니다. LMD 현미경을 사용할 수 있다고합니다,이 절차는이를 모두 비 당뇨병과 2 형 당뇨병 환자 과목에서 인간의 작은 섬 소재에 대한 액세스를 증가, 부분 pancreatectomies를 수행하는 연구 기관에서 구현 될 수 있습니다. 이 작은 섬 고립에 제공 pancreata의 소수 주어진 특히 해당됩니다. 의 Favourable ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 프로젝트의 여러 단계에 도움, 조언과 중요한 입력을 제공하는 모든 동료에게 감사하고 싶습니다. 이 비디오 문서의 생산은 IMIDIA (의 자금이 지원 된 http://www.imidia.org ), 교육 및 당뇨병 연구 독일 센터 (DZD로 연구 (BMBF)에 대한 독일의 성 http://www.dzd – ev.de ) 기술 드레스덴 (Dresden)의 대학에서 대학 병원 칼 구스타프 이카루스 호. 이 책자에 이르는 작품 부여 계약을 N ° 155005 (IMIDIA), 유럽 연합 (EU)의 7 번째 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)와 EFPIA에서 금전적 인 기부로 구성되어있는 자원을 아래에 혁신적인 의약품 사업 공동 인수의 지원을 받고 있습니다 회사의 종류 기여 인치
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22×22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
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