Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben
Summary
Lasermikrodissektion ist eine Technik, die die Gewinnung von ausgewählten Zellen aus winzigen Mengen von Parenchym ermöglicht. Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Erfassen menschlicher Pankreasinseln aus chirurgischen Proben für transkriptomischen Studien verwendet werden. Unser Protokoll verbessert die intrinsische Autofluoreszenz der menschlichen Beta-Zellen und erleichtert so ihre Sammlung.
Abstract
Lasermikrodissektion (LMD) ist eine Technik, die die Rückgewinnung ausgewählter Zellen und Geweben von winzigen Mengen von Parenchym 1,2 ermöglicht. Die präparierten Zellen können für eine Vielzahl von Untersuchungen, wie transkriptomischen oder Proteom-Studien, DNA Beurteilung oder Chromosomenanalyse 2,3 verwendet werden. Eine besonders anspruchsvolle Anwendung von LMD Transkriptomanalyse ist, die aufgrund der Labilität der RNA 4, besonders ausgeprägt, wenn die von Geweben, die reich von RNasen, wie der Bauchspeicheldrüse sind seziert kann. Ein Protokoll, das Mikrodissektion schnelle Identifikation und Erfassung von Zielzellen ermöglicht ist in dieser Einstellung, um das Gewebe Handhabung zu verkürzen und damit zu RNA-Konservierungsmedien zu gewährleisten.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Erfassen menschlichen Pankreas-Beta-Zellen aus chirurgischen Proben für transkriptomischen Studien 5 verwendet werden. Kleine Stücke der Bauchspeicheldrüse von etwa 0,5-1 cm 3 wurden von den gesunden erscheinenden Rande der resezierten Bauchspeicheldrüse Proben, in Tissue-Tek OCT Compound eingebettet, sofort gekühlt 2-Methylbutan zerteilt gefroren und bei -80 ° C bis zum Schneiden. Vierzig Serienschnitten von 10 um Dicke wurden auf einem Kryostaten bei -20 ° C eine Einstellung geschnitten, individuell auf Glasobjektträgern im Kryostat für 1-2 Minuten getrocknet, und bei -80 ° C überführt
Unmittelbar vor der Lasermikrodissektion Verfahrens wurden die Schnitte fixiert in eiskaltem, frisch zubereitete 70% Ethanol für 30 sec. gewaschen, um 5-6 Dips in eiskaltem DEPC-behandeltem Wasser und entwässert durch zwei einminütigen Inkubationen in eiskaltem 100% Ethanol gefolgt von Xylol (welches zum Gewebe Dehydratisierung verwendet) für 4 min; Gewebeschnitte wurden dann luftgetrocknet anschließend für 3-5 min. Wichtig ist, dass alle Schritte, mit Ausnahme der Inkubation in Xylol, wurden mit eiskaltem Reagenzien – eine Änderung über einen zuvor beschriebenen Protokoll 6. Utilization eiskaltem Reagenzien führte zu einem deutlichen Anstieg der intrinsischen Autofluoreszenz der Beta-Zellen, und erleichtert ihre Anerkennung. Für Mikrodissektion wurden vier Abschnitte dehydratisiert jeweils erneut beiden wurden in einer Folie umwickelte 50 ml Röhrchen gegeben, um das Gewebe vor Feuchtigkeit schützen und Bleichen; die verbleibenden zwei wurden sofort mikrodissezierten. Dieses Verfahren wurde unter Verwendung eines PALM MicroBeam Instrument (Zeiss) unter Verwendung der Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) Modus. Der Abschluss der Beta-Zell-/ Insel Dissektion von vier Kryoschnitten nicht länger als 40-60 min benötigt. Zellen wurden in ein AdhesiveCap gesammelt und lysiert mit 10 ul Lysepuffer. Jede einzelne RNA Probe für Transkriptom-Analyse wurde durch die Kombination von 10-Zellen mikrodissezierten Proben, gefolgt von RNA Extraktion mit dem Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus) erhalten. Dieses Protokoll verbessert die intrinsische Autofluoreszenz der menschlichen Beta-Zellen, um so ihren schnellen und präzisen Erkennung und collection. Weitere Verbesserung dieses Verfahrens konnte ermöglichen die Dissektion der phänotypisch unterschiedlichen Beta-Zellen, mit möglichen Folgen für ein besseres Verständnis der Veränderungen mit Typ 2 Diabetes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir beschreiben einen zuverlässigen Ansatz für die Laser-Mikrodissektion (LMD) der menschlichen Inselzellen von chirurgischen Pankreas Probe. Sofern ein LMD Mikroskop zur Verfügung steht, könnte dieses Verfahren an irgendeiner Forschungseinrichtung Ausführung partieller Pankreatektomien umgesetzt werden, wodurch sich Zugang zu menschlichen Inseln Material aus beiden Nicht-Diabetiker und Typ 2 Diabetikern. Dies ist besonders relevant in Anbetracht der Mangel an Bauchspeicheldrüsen für Inselisolierung angeboten. Vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir wollen alle unsere Kollegen, die Hilfe, Rat und kritischen Input auf verschiedenen Stufen des Projektes bedanken. Die Produktion dieses Video Artikel wurde aus Mitteln IMIDIA (unterstützt http://www.imidia.org ), das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) mit dem Deutschen Zentrum für Diabetesforschung (DZD, http://www.dzd -ev.de ) und das Universitätsklinikum Carl Gustav Carus an der Technischen Universität Dresden. Die Arbeiten, die zu dieser Veröffentlichung wird unterstützt von der Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking erhalten unter Finanzhilfevereinbarung n ° 155005 (IMIDIA), Ressourcen, von denen die finanzielle Beteiligung Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (FP7/2007-2013) und EFPIA bestehen Unternehmen in Form von Sachleistungen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22×22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
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