Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos
Summary
Microdissecção a laser é uma técnica que permite a recuperação de células selecionadas a partir de pequenas quantidades de parênquima. Aqui descrevemos um protocolo de aquisição ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic. Nosso protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim a sua coleção.
Abstract
Microdissecção a laser (LMD) é uma técnica que permite a recuperação de células e tecidos seleccionados a partir de quantidades diminutas de parênquima 1,2. As células dissecadas pode ser usado para uma variedade de investigações, como estudos transcriptomic ou proteômica, avaliação ou análise de ADN cromossómico 2,3. Uma aplicação especialmente difícil de LMD é a análise de transcriptoma, o qual, devido à instabilidade do ARN 4, pode ser particularmente importante quando as células são dissecados a partir de tecidos que são ricos de RNases, tais como o pâncreas. Um protocolo de microdissecção que permite a identificação rápida e recolha de células-alvo é essencial nesta configuração, a fim de encurtar o tempo de tratamento do tecido e, consequentemente, para assegurar a preservação do RNA.
Aqui descrevemos um protocolo para a obtenção de células beta pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos para serem utilizados para estudos de transcriptomic 5. Pequenos pedaços de pâncreas de cerca de 0,5-1 cm 3 foram cortados a partir das margens saudáveis constantes de espécimes pâncreas extirpado, embebidos em composto Tissue-Tek OCT, imediatamente congelados em 2-metilbutano, refrigerada e armazenado a -80 ° C até que o corte. Quarenta secções seriadas de 10 um de espessura foram cortadas num criostato com uma configuração de -20 ° C, transferidas individualmente para lâminas de vidro, secou-se no interior do criostato durante 1-2 min e armazenado a -80 ° C.
Imediatamente antes do procedimento de microdissecção a laser, as secções foram fixadas em frio de gelo, preparada de fresco de etanol a 70% durante 30 segundos, lavou-se por 5-6 depressões em gelo água tratada com DEPC a frio, e desidratado por duas incubações de um minuto em gelo 100% frio etanol seguido de xileno (que é utilizado para a desidratação do tecido) durante 4 min; secções de tecido foram então secos ao ar depois de 3-5 min. Mais importante ainda, todos os passos, excepto a incubação em xileno, foram realizadas utilizando geladas reagentes – uma modificação ao longo de um protocolo previamente descrito 6. Utilization de reagentes geladas resultou num aumento acentuado da autofluorescência intrínseca das células beta, e facilitado o seu reconhecimento. Por microdissecção, quatro secções foram desidratadas de cada vez: dois foram colocados em um tubo de ml embrulhado em papel alumínio 50, para proteger o tecido da humidade e de branqueamento, os dois restantes foram imediatamente microdissecados. Este procedimento foi realizado utilizando um instrumento PALM MicroBeam (Zeiss) empregando a pressão Laser Auto Catapulting (AutoLPC) de modo. A conclusão da célula beta / dissecção ilhota a partir de quatro criocortes necessários não mais do que 40-60 min. As células foram recolhidas para um AdhesiveCap e lisadas com 10 ul de tampão de lise. Cada amostra de RNA simples para análise transcriptomic foi obtida através da combinação de 10 amostras de células microdissecadas, seguido por extracção de ARN usando o Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Este protocolo melhora a autofluorescência intrínseca das células beta humanas, facilitando assim o seu reconhecimento rápido e preciso e collection. Melhorar ainda mais este procedimento poderia permitir que a dissecção das células beta fenotipicamente diferentes, com possíveis implicações para uma melhor compreensão das mudanças associadas com o diabetes tipo 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós descrevemos uma abordagem confiável para a microdissecção a laser (LMD) de ilhotas de pâncreas humanos de uma amostra cirúrgica. Desde que um microscópio LMD está disponível, este procedimento poderia ser implementado em qualquer instituição de pesquisa realizando pancreatectomies parciais, aumentando assim o acesso ao material ilhota humana de ambos os não-diabéticos e diabéticos tipo 2. Isto é especialmente relevante dada a escassez de pâncreas oferecido para isolamento de ilhotas. Aspectos favorá…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer a todos os nossos colegas que prestaram ajuda, conselhos e críticas de entrada em várias etapas deste projeto. Produção de vídeo deste artigo foi apoiado com recursos do IMIDIA ( http://www.imidia.org ), o Ministério alemão da Educação e Pesquisa (BMBF) para o Centro Alemão de Pesquisa do Diabetes (DZD, http://www.dzd -ev.de ) e do Hospital Universitário Carl Gustav Carus, da Universidade de Tecnologia de Dresden. Os trabalhos que conduziram a esta publicação recebeu o apoio da empresa Iniciativa sobre Medicamentos Inovadores comum ao abrigo do acordo de subvenção n ° 155005 (IMIDIA), os recursos de que são compostos de contribuição financeira do Programa da União Europeia Quadro (FP7/2007-2013) e EFPIA empresas "contribuição em espécie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22×22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
- Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).
