Protocole amélioré pour la microdissection laser d'îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux
Summary
Microdissection laser est une technique qui permet la récupération des cellules sélectionnées à partir des quantités infimes de parenchyme. Nous décrivons ici un protocole pour l'acquisition des îlots pancréatiques humains à partir de spécimens chirurgicaux être utilisés pour les études transcriptomiques. Notre protocole améliore l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta humaines, facilitant ainsi leur collection.
Abstract
Microdissection laser (LMD) est une technique qui permet la récupération des cellules et des tissus sélectionnés à partir des quantités infimes de 1,2 parenchyme. Les cellules disséqués peut être utilisé pour une variété d'enquêtes, telles que les études de transcriptomique ou la protéomique, l'évaluation de l'ADN ou l'analyse chromosomique 2,3. Une application particulièrement difficile du LMD est l'analyse du transcriptome, qui, en raison de la labilité de l'ARN 4, peut être particulièrement importante lorsque les cellules sont disséqués à partir de tissus qui sont riches de RNases, comme le pancréas. Un protocole de microdissection qui permet une identification rapide et la collecte de cellules cibles est essentielle dans ce cadre afin de raccourcir le temps de traitement des tissus et, par conséquent, d'assurer la conservation d'ARN.
Nous décrivons ici un protocole pour l'acquisition des cellules bêta pancréatiques à partir de spécimens chirurgicaux être utilisés pour les études transcriptomiques 5. De petits morceaux de pancréas de environ 0,5-1 cm 3 ont été découpés à partir des marges saines apparaissant de spécimens du pancréas réséqués, noyés dans du Tissue-Tek OCT, composé immédiatement congelés dans réfrigéré 2-méthylbutane, et conservés à -80 ° C jusqu'à ce que la coupe. Quarante coupes sériées de 10 um d'épaisseur ont été coupées au cryostat dans un cadre de -20 ° C, transférés individuellement dans des lames de verre, séché à l'intérieur du cryostat pendant 1-2 min, et conservés à -80 ° C.
Immédiatement avant la procédure de microdissection laser, coupes ont été fixées dans le froid de la glace, fraîchement préparé l'éthanol à 70% pendant 30 sec, lavé par 5-6 plonge dans la glace froide eau traitée au DEPC, et déshydratée par deux incubations d'une minute dans la glace froide 100% l'éthanol suivie par le xylène (qui est utilisé pour la déshydratation des tissus) pendant 4 min; coupes de tissus ont ensuite été séchés à l'air pendant 3-5 min après. Surtout, toutes les mesures, à l'exception de l'incubation dans du xylène, ont été effectuées à l'aide glacées réactifs – une modification sur un protocole décrit précédemment 6. Utahilization de réactifs glacées entraîné une augmentation marquée de l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta, et de faciliter leur reconnaissance. Pour microdissection, quatre sections ont été déshydratées à chaque fois: deux ont été placés dans une feuille gainé de tube de 50 ml, pour protéger le tissu de l'humidité et de blanchiment, les deux autres ont été immédiatement microdisséqué. Cette procédure a été réalisée à l'aide d'un instrument PALM MicroBeam (Zeiss) en utilisant la pression Laser automatique Ejection (AutoLPC) mode. L'achèvement de la cellule bêta / dissection îlot de quatre cryosections requis ne dépasse pas 40-60 min. Les cellules ont été rassemblés dans un AdhesiveCap et lysées avec 10 ul de tampon de lyse. Chaque échantillon d'ARN unique pour l'analyse du transcriptome a été obtenue en combinant des échantillons de 10 cellules par microdissection, suivie d'une extraction d'ARN en utilisant le Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Ce protocole améliore l'autofluorescence intrinsèque des cellules bêta humaines, facilitant ainsi leur reconnaissance rapide et exacte, et collection. Poursuite de l'amélioration de cette procédure pourrait permettre la dissection des cellules bêta phénotypiquement différentes, avec des implications possibles pour mieux comprendre les changements liés à diabète de type 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons une approche fiable pour la microdissection laser (LMD) des îlots pancréatiques humains à partir spécimen chirurgical. À condition qu'un microscope LMD est disponible, cette procédure pourrait être appliquée à tout établissement de recherche effectuant pancréatectomies partielles, augmentant ainsi l'accès au matériel îlots humains à partir de deux 2 non-diabétiques et les sujets diabétiques de type. Ceci est particulièrement pertinent étant donné la rareté de pancréas offert…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier tous nos collègues qui ont fourni de l'aide, des conseils et des intrants essentiels à différentes étapes de ce projet. La production de cet article vidéo a été appuyée par des fonds IMIDIA ( http://www.imidia.org ), le ministère allemand de l'Education et de la Recherche (BMBF) pour le Centre allemand de recherche sur le diabète (DZD, http://www.dzd -ev.de ) et l'hôpital universitaire Carl Gustav Carus de l'Université de technologie de Dresde. Les travaux menant à cette publication a reçu le soutien de l'entreprise Initiative médicaments innovants conjoint en vertu de convention de subvention n ° 155005 (IMIDIA), les ressources qui sont composées de la contribution financière du Programme de l'Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) et l'EFPIA entreprises «contribution en nature.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22×22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
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