Verbeterd protocol voor Laser Microdissection der humane pancreatische eilandjes Van Chirurgische Specimens
Summary
Laser microdissectie is een techniek die het herstel van de geselecteerde cellen uit minieme hoeveelheden parenchym mogelijk maakt. Hier beschrijven we een protocol voor die menselijke pancreatische eilandjes van chirurgische preparaten worden gebruikt voor transcriptoom studies. Ons protocol verbetert de intrinsieke autofluorescentie van menselijke beta-cellen, waardoor hun collectie.
Abstract
Laser microdissectie (LMD) is een techniek die het herstel van de geselecteerde cellen en weefsels van kleine hoeveelheden parenchym 1,2 toelaat. De gedissecteerde cellen kunnen worden gebruikt voor verschillende onderzoeken, zoals transcriptoom of proteomische studies, DNA assessment of chromosoomanalyse 2,3. Een bijzondere uitdaging toepassing van LMD transcriptoomanalyse, die vanwege de labiliteit van RNA 4, kan bijzonder prominent wanneer cellen worden geprepareerd uit weefsels die rijk RNases zoals de pancreas. Een microdissection protocol dat snelle identificatie en verzameling van doelwitcellen kan essentieel in deze instelling om het weefsel verwerkingstijd verkorten en dus om RNA houdbaarheid.
Hier beschrijven we een protocol voor die menselijke pancreatische beta cellen van chirurgische specimens worden gebruikt voor studies transcriptoom 5. Kleine stukjes van de alvleesklier van ongeveer 0,5-1 cm 3 werden uit de gezonde weergegeven marges van operatief pancreas specimens, ingebed in Tissue-Tek oktober verbinding, direct ingevroren in 2-methylbutaan gekoeld en opgeslagen bij -80 ° C tot snijden. Veertig seriële secties van 10 um dikte werden gesneden op een cryostaat onder -20 ° C instelling afzonderlijk overgebracht naar glazen objectglaasjes, gedroogd in de cryostaat voor 1-2 min en bewaard bij -80 ° C.
Onmiddellijk vóór de laser microdissectie procedure werden secties gefixeerd in ijskoude, versbereide 70% ethanol gedurende 30 seconden, gewassen met 5-6 dips in ijskoud DEPC-behandeld water, en gedroogd door twee minuut incubaties in ijskoude 100% ethanol gevolgd door xyleen (die wordt gebruikt voor weefseldehydratatie) gedurende 4 min; weefselcoupes werden vervolgens aan de lucht gedroogd daarna gedurende 3-5 min. Belangrijker alle stappen behalve de incubatie in xyleen werden uitgevoerd met ijskoude reagentia – een wijziging op een eerder beschreven protocol 6. Utilization van ijskoude reagentia resulteerde in een sterke stijging van de intrinsieke autofluorescentie van beta-cellen, en gefaciliteerd hun erkenning. Voor microdissectie, vier secties werden gedehydrateerd telkens: twee werden in een folie verpakte 50 ml buis, het weefsel bescherming tegen vocht en bleken, de twee andere werden onmiddellijk gemicrodissecteerde. Deze procedure werd uitgevoerd met een PALM microbundel instrument (Zeiss) onder toepassing van de Auto Laser Pressure Wegslingeren (AutoLPC) mode. De voltooiing van beta cel / eilandje dissectie van vier cryocoupes die niet meer nodig zijn dan 40-60 min.. Cellen werden verzameld in een AdhesiveCap en gelyseerd met 10 ui lysis buffer. Elke afzonderlijke RNA monster voor transcriptoom analyse werd verkregen door het combineren van 10 cellen gemicrodissecteerde monsters, gevolgd door RNA-extractie met behulp van de Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Dit protocol verbetert de intrinsieke autofluorescentie van menselijke beta-cellen, waardoor hun snelle en accurate herkenning en collectie. Verdere verbetering van deze procedure in staat kan stellen de dissectie van fenotypisch verschillende beta-cellen, met mogelijke consequenties voor een beter begrip van de veranderingen die gepaard gaan met diabetes type 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven een betrouwbare aanpak voor de laser microdissectie (LMD) van menselijke eilandjes van chirurgische pancreas exemplaar. Op voorwaarde dat een LMD microscoop beschikbaar is, kan deze procedure worden toegepast op elk onderzoeksinstelling het uitvoeren van een gedeeltelijke pancreatectomies, waardoor de toegang tot de menselijke eilandje materiaal van zowel niet-diabetische en type 2 diabetes. Dit is vooral van belang omdat het gebrek aan pancreata aangeboden eilandje isolatie. Gunstige aspecten van LMD opz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen al onze collega's die hulp, advies en kritische inbreng van de verschillende stappen van dit project bedanken. De productie van deze video artikel werd ondersteund met middelen van IMIDIA ( http://www.imidia.org ), het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) aan het Duitse Centrum voor Diabetes Onderzoek (DZD, http://www.dzd -ev.de ) en het Universitair Ziekenhuis Carl Gustav Carus aan de University of Technology Dresden. De werkzaamheden die leiden tot deze publicatie heeft steun gekregen van het Innovative Medicines Initiative gemeenschappelijke onderneming onder subsidieovereenkomst nr. 155005 (IMIDIA), middelen waarvan van de financiële bijdrage bestaat uit Zevende Kaderprogramma van de Europese Unie (FP7/2007-2013) en EFPIA bedrijven 'in natura bijdrage.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22×22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
- Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).
