从手术标本的人类胰岛细胞激光显微切割的改进方法
Summary
激光显微切割是一种技术，使选定单元格的恢复微量的实质。在这里，我们描述了一个协议，收购手术标本用于转录组研究人类胰岛。我们的协议提高了内在的自发荧光的人类β细胞，从而有利于他们的收藏。
Abstract
激光显微切割（LMD）是一种技术，它允许微量的实质1,2选定的细胞和组织的恢复。解剖的细胞可以用于各种调查，如转录或蛋白质组的研究中，DNA的评估或染色体分析2,3。尤其是具有挑战性的应用LMD转录组分析，由于4 RNA的不稳定性，可以表现尤为突出，有丰富的核糖核酸酶，如胰腺组织细胞解剖时。一个显微切割技术协议，能够快速识别和收集的靶细胞，在此设置中是必不可少的，以组织处理时间缩短，因此，为确保RNA保存。
在这里，我们描述了一种协议，用于获取要用于转录研究5从手术标本的人胰岛β细胞。小件胰腺约0.5-1Çm 3的被切断从健康出现边缘切除胰腺标本，嵌入在Tissue-Tek OCT化合物中，立即冷冻冷藏2 -甲基丁烷，并保存在-80℃下，直到切片。 40连续切片厚度为10μm的低温恒温器上切下在-20°C的设置，传送单独的载玻片，在低温恒温器内干燥1-2分钟，并储存于-80℃。
紧随激光显微切割过程之前，在冰冷的固定切片，新鲜制备的70％乙醇中30秒，由冰冷DEPC-处理水的5-6蘸洗涤，并脱水，在冰冷的100％由两个一分钟的孵育乙醇后跟二甲苯（这是用于组织脱水）4分钟，组织切片，然后空气干燥，之后为3-5分钟。更重要的是，所有的步骤，但在二甲苯的潜伏期，进行使用冰冷试剂-一个修改过先前描述的协议6。 UTilization冰冷的试剂导致β细胞的内在自发荧光的显着增长，促进了他们的认可。显微切割，四个部分脱水，每次放入一个用箔纸包裹50毫升管，以保护组织的水分和漂白;，立即显微剩下的两个人。使用PALM微束仪器（蔡司）采用自动激光压力弹射模式（AutoLPC）的程序进行。的完成四个冰冻切片不再需要40-60分钟的β细胞/胰岛夹层。将细胞成一个AdhesiveCap收集，并与10μl的裂解缓冲液中裂解。每个单个RNA转录组分析用试样，得到通过组合10个细胞显微切割的样品，随后使用的Pico纯RNA分离试剂盒（大角星）RNA提取。该协议提高了内在的自发荧光的人类β细胞，从而促进他们的快速，准确识别和collection。进一步改进这个程序可以使β细胞的表型不同的解剖，更好地理解与2型糖尿病有关的变化可能产生的影响。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们描述了一种可靠的方法，激光显微切割（LMD）的人类胰岛，胰腺手术标本。 ，一个LMD显微镜的，这个程序可以在任何研究机构进行部分胰脏，从而提高了进入人体胰岛材料从非糖尿病和2型糖尿病患者。缺乏所提供的胰腺的胰岛分离，这一点尤其重要。有利的方面，LMD通过胶原酶消化胰岛分离相比是减少外植的组织之间的时间和处理的胰岛的β细胞的富集7，以及避免苛刻的机械和酶操…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢我们的同事提供帮助，建议和重要的投入在这个项目的各个步骤。生产视频文章从IMIDIA（ http://www.imidia.org ），德国联邦教育和研究部（BMBF）德国糖尿病研究中心（， http://www.dzd DZD的资金支持ev.de ）和大学医院的卡尔·古斯塔夫·卡鲁斯在德累斯顿技术大学。导致本出版物的工作已获得创新药物计划联合执行体的支持下赠款协议N°155005（IMIDIA），资源的财政贡献，这是由欧盟的第七框架计划（FP7/2007-2013）和EFPIA公司的实物捐助。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22×22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
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