Protocolo mejorado para microdisección láser de islotes pancreáticos humanos a partir de muestras quirúrgicas
Summary
Microdisección por láser es una técnica que permite la recuperación de células seleccionados a partir de cantidades mínimas de parénquima. Aquí se describe un protocolo para la obtención islotes pancreáticos humanos a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para transcriptomic estudios. Nuestro protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su recogida.
Abstract
Microdisección por láser (LMD) es una técnica que permite la recuperación de células y tejidos seleccionados de pequeñas cantidades de parénquima 1,2. Las células disecadas se puede utilizar para una variedad de investigaciones, tales como transcriptomic estudios o proteómica o análisis de evaluación de ADN cromosómico de 2,3. Una aplicación especialmente difícil de LMD es el análisis de transcriptoma, que, debido a la labilidad del ARN 4, puede ser particularmente importante cuando las células se disecan a partir de tejidos que son ricos de RNasas, tales como el páncreas. Un protocolo de microdisección que permite una rápida identificación y colección de las células diana es esencial en este contexto con el fin de acortar el tiempo de la manipulación de tejidos y, en consecuencia, para garantizar la conservación de ARN.
Aquí se describe un protocolo para la obtención humanos las células beta pancreáticas a partir de especímenes quirúrgicos para su uso para los estudios de transcriptomic 5. Pequeños trozos de páncreas de aproximadamente 0.5-1 c3 m se cortaron de los márgenes sanos que aparecen de páncreas especímenes resecados, embebidos en Tissue-Tek compuesto OCT, se congeló inmediatamente en 2-metilbutano enfriado, y se almacenó a -80 ° C hasta el corte. Cuarenta secciones en serie de 10 m de espesor se cortaron en un criostato en virtud de un ajuste de -20 ° C, se transfirieron individualmente a portaobjetos de vidrio, se seca el interior del criostato durante 1-2 min, y se almacenaron a -80 ° C.
Inmediatamente antes de que el procedimiento de microdisección por láser, las secciones fueron fijadas en hielo frío, recién preparada 70% de etanol durante 30 segundos, se lavó por 5-6 inmersiones en hielo frío agua tratada con DEPC, y se deshidrató por dos incubaciones de un minuto en hielo frío 100% etanol seguido de xileno (que se utiliza para la deshidratación de los tejidos) durante 4 min; secciones de tejido fueron entonces secados al aire después de 3-5 min. Es importante destacar que todas las etapas, excepto la incubación en xileno, se realizaron con reactivos de agua helada – una modificación más de un protocolo descrito previamente 6. Utahilization de reactivos de hielo frío resultó en un aumento pronunciado de la autofluorescencia intrínseca de las células beta, y facilitar su reconocimiento. Para la microdisección, cuatro secciones se deshidrataron cada vez: dos fueron colocados en un tubo de ml envueltas en papel aluminio 50, para proteger el tejido de la humedad y el blanqueo; los dos restantes se microdissected inmediatamente. Este procedimiento se realizó con un PALM MicroBeam instrumento (Zeiss) que utiliza el láser de presión automático Catapulting (AutoLPC) de modo. La finalización de las células beta / islotes disección a partir de cuatro secciones criogénicas requeridos no más de 40-60 min. Las células se recogen en una AdhesiveCap y se lisaron con 10 l de tampón de lisis. Cada espécimen único ARN para el análisis transcriptomic se obtuvo mediante la combinación de 10 muestras de células microdisecadas, seguido de extracción de ARN usando el Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Este protocolo mejora la autofluorescencia intrínseca de las células beta humanas, lo que facilita su reconocimiento rápido y preciso y collection. Nuevas mejoras en este procedimiento podría permitir la disección de las células beta fenotípicamente diferentes, con posibles consecuencias para la mejor comprensión de los cambios asociados con la diabetes tipo 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se describe un método fiable para la microdisección láser (LMD) de los islotes de páncreas espécimen quirúrgico. Siempre que un microscopio LMD está disponible, este procedimiento podría aplicarse a cualquier institución de investigación la realización de pancreatectomías parciales, lo que aumenta el acceso a material de islotes humanos de ambos no diabéticos y diabéticos de tipo 2. Esto es especialmente relevante dada la escasez de páncreas ofrecido para el aislamiento de los islotes. Aspectos favorables…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer a todos nuestros colegas que brindaron ayuda, consejo y aporte decisivo en diversas etapas de este proyecto. La producción de este artículo vídeo fue apoyado con fondos de IMIDIA ( http://www.imidia.org ), el Ministerio alemán de Educación e Investigación (BMBF) para el Centro Alemán para la Investigación de la Diabetes (DZD, http://www.dzd -ev.de ) y el Hospital Universitario Carl Gustav Carus en la Universidad de Tecnología de Dresde. El trabajo que lleva a esta publicación ha recibido apoyo de la Empresa iniciativa sobre medicamentos innovadores mixta de acuerdo con acuerdo de subvención n ° 155005 (IMIDIA), los recursos de los cuales están compuestos por la contribución financiera del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) y la EFPIA empresas "contribución en especie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22×22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
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