Forbedret protokol for Laser mikrodissektion Of Menneskelige pancreasøer fra kirurgiske Prøver
Summary
Laser mikrodissektion er en teknik, som muliggør genvinding af udvalgte celler fra små mængder af parenchym. Her beskriver vi en protokol for at erhverve de menneskelige pancreasøer fra kirurgiske enheder, der skal bruges til transkriptomisk undersøgelser. Vores protokol forbedrer den iboende autofluorescens af humane betaceller, hvilket letter deres samling.
Abstract
Laser mikrodissektion (LMD) er en teknik, der tillader inddrivelse af udvalgte celler og væv fra små mængder af parenkym 1,2. De dissekerede celler kan anvendes til forskellige undersøgelser, såsom transkriptom eller proteom undersøgelser, DNA vurdering eller kromosomanalyse 2,3. En særligt udfordrende anvendelse af LMD er transkriptomet analyse, som på grund af labiliteten af RNA 4, kan være særlig fremtrædende, når cellerne dissekeres fra væv, der er rige af RNaser, såsom pancreas. En mikrodissektion protokol, der muliggør hurtig identifikation og indsamling af målceller er afgørende i denne indstilling for at afkorte vævet håndtering tid og dermed for at sikre RNA konservering.
Her beskriver vi en protokol for at erhverve betaceller fra menneskets bugspytkirtel fra kirurgiske enheder, der skal bruges til transkriptomisk undersøgelser 5. Små stykker af pancreas fra ca 0,5 til 1 cm 3 blev udskåret fra de sunde anført tilknytning operativt fjernede pancreas prøver, indlejret i Tissue-Tek OCT-forbindelse, øjeblikkeligt nedfrosset i kølede 2-methylbutan og opbevaret ved -80 ° C indtil skæring. Fyrre serielle sektioner af 10 um tykkelse blev skåret på en kryostat i henhold til en -20 ° C indstilling, overført individuelt til glasplader, tørret inde i kryostaten i 1-2 min, og opbevaret ved -80 ° C.
Umiddelbart før laser mikrodissektion procedure blev snit fikseret i iskold, frisk fremstillet 70% ethanol i 30 sekunder, vaskes med 5-6 dyk i iskold DEPC-behandlet vand og dehydratiseret med to en-minutters inkubationer i iskoldt 100% ethanol efterfulgt af xylen (som anvendes til væv dehydrering) i 4 min; Vævssnit blev derefter lufttørret bagefter i 3-5 min. Vigtigere, alle trin med undtagelse af inkubering i xylen, udføres brugte iskolde reagenser – en modifikation i løbet af en tidligere beskrevet protokol 6. Utilization iskold reagenser resulterede i en markant stigning af den indre autofluorescens af betaceller, og lettet deres anerkendelse. Til mikrodissektion, var fire sektioner dehydrerede hver gang: to blev anbragt i en folieomviklede 50 ml glas for at beskytte vævet mod fugt og blegning, de resterende to straks blev microdissected. Denne procedure blev udført ved anvendelse af en PALM MicroBeam instrument (Zeiss) under anvendelse af Auto Laser Pressure catapulting (AutoLPC) tilstand. Færdiggørelsen af beta celle / ø dissektion fra fire kryosektioner kræves ikke længere end 40-60 min. Celler blev opsamlet i en AdhesiveCap og lyseret med 10 pi lysisbuffer. Hver enkelt RNA-prøve for transkriptom analyse blev opnået ved at kombinere 10 celle microdissected prøver, efterfulgt af RNA-ekstraktion ved hjælp af Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Denne protokol forbedrer den iboende autofluorescens af humane betaceller, hvilket letter deres hurtige og præcise anerkendelse og collection. Yderligere forbedring af denne procedure kunne gøre det muligt dissektion af fænotypisk forskellige betaceller, med mulige konsekvenser for bedre at forstå de ændringer, der er forbundet med type 2 diabetes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en pålidelig metode til laser mikrodissektion (LMD) af humane øer fra kirurgisk pancreas prøve. Forudsat at en LMD mikroskop er tilgængelig, kan denne procedure gennemføres på ethvert forskningsinstitution udfører delvise pancreatectomies og derved øge adgangen til menneskelig ø materiale fra både ikke-diabetiske og type 2-diabetikere. Dette er især relevant i betragtning af knapheden på pancreas udbydes til ø-isolation. Gunstige aspekter af LMD sammenlignet med ø-isolering ved collagenaseford…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke alle vores kolleger, der har givet hjælp, råd og kritiske input på forskellige trin i dette projekt. Produktion af denne video artikel blev støttet med midler fra IMIDIA ( http://www.imidia.org ), det tyske ministerium for Uddannelse og Forskning (BMBF) til det tyske Centre for Diabetes Research (DZD, http://www.dzd -ev.de ) og University Hospital Carl Gustav Carus på University of Technology Dresden. Arbejdet har resulteret i denne publikation har modtaget støtte fra initiativet om innovative lægemidler fællesforetagende under tilskudsaftale nr. 155.005 (IMIDIA), ressourcer, som er sammensat af tilskud fra Den Europæiske Unions syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA virksomheders naturalier bidrag.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22×22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
- Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).
