Forbedret protokoll For Laser mikrodisseksjon Of Human bukspyttkjertelen holmer Fra Kirurgiske prøver
Summary
Laser mikrodisseksjon er en teknikk som tillater utvinningen av utvalgte celler fra små mengder av parenchyma. Her beskriver vi en protokoll for å anskaffe humane pankreatiske øyer fra kirurgiske prøver som skal brukes til transcriptomic studier. Vår protokoll forbedrer den iboende autofluorescens av menneskelige beta-cellene, og dermed tilrettelegge sin samling.
Abstract
Laser mikrodisseksjon (LMD) er en teknikk som gjør at utvinning av utvalgte celler og vev fra små mengder av parenchyma 1,2. Den dissekerte celler kan brukes for en rekke undersøkelser, for eksempel transcriptomic eller proteomikk studier, DNA vurdering eller kromosomal analyse 2,3. En spesielt utfordrende anvendelse av LMD er transkriptom analysen, som, på grunn av labilitet av RNA 4, kan være spesielt fremtredende når cellene dissekert fra vev som er rike på RNases som bukspyttkjertelen. En mikrodisseksjon protokoll som muliggjør rask identifisering og innsamling av målcellene er viktig i denne innstillingen for å forkorte vev håndtering tid og dermed å sikre RNA bevaring.
Her beskriver vi en protokoll for å anskaffe menneskelige bukspyttkjertelens betaceller fra kirurgiske prøver som skal brukes for transcriptomic studier fem. Små biter av bukspyttkjertelen på ca 0,5 til 1 cm 3 ble kuttet fra de sunne vises marginene reseksjon bukspyttkjertel prøver, innebygd i Tissue-Tek oktober Compound, umiddelbart frosset i kjølt 2-metylbutan, og lagret ved -80 ° C til snitting. Førti seriesnitt av 10 um tykkelse ble kuttet på en kryostat under en -20 ° C-innstillingen, overført individuelt til glassplater, tørkes inne i kryostaten i 1-2 min, og lagret ved -80 ° C.
Umiddelbart før laser mikrodisseksjon prosedyren ble deler fast i iskald, tilberedes 70% etanol i 30 sek, vasket med 5-6 fall i iskald DEPC-behandlet vann, og dehydrert av to ett-minutts inkubasjoner i iskaldt 100% etanol etterfulgt av xylen (som brukes for vev dehydrering) etter 4 min; vevssnitt ble deretter lufttørket etterpå i 3-5 min. Viktigere, alle trinnene, bortsett inkubasjonen i xylen, som ble utført med iskalde reagenser – en modifikasjon over en tidligere beskrevet protokoll 6. Utilization iskald reagenser resulterte i en markant økning av den indre autofluorescens av beta-cellene, og tilrettelagt deres anerkjennelse. For mikrodisseksjon, var fire seksjoner dehydrert hver gang: to ble plassert i en folie-innpakket 50 ml tube, for å beskytte vev fra fuktighet og bleking, og de resterende to ble umiddelbart microdissected. Denne prosedyren ble utført ved hjelp av en PALM Microbeam instrument (Zeiss) ansette Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC)-modus. Ferdigstillelse av beta celle / holme disseksjon fra fire cryosections kreves ikke lenger enn 40-60 min. Celler ble samlet i en AdhesiveCap og lysert med 10 ul lyseringsbuffer. Hver enkelt RNA prøven for transcriptomic analyse ble oppnådd ved å kombinere 10 celle microdissected prøver, etterfulgt av RNA ekstraksjon med Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). Denne protokollen forbedrer den iboende autofluorescens av menneskelige beta-cellene, og dermed tilrettelegge deres raske og nøyaktige anerkjennelse og collection. Ytterligere forbedring av denne fremgangsmåten kan muliggjøre disseksjon av fenotypisk forskjellige beta-celler, med mulige implikasjoner for bedre forståelse av endringer forbundet med type 2-diabetes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en pålitelig metode for laser mikrodisseksjon (LMD) av menneskelige holmer fra kirurgisk bukspyttkjertelen prøven. Forutsatt at en LMD mikroskop er tilgjengelig, kan denne prosedyren bli implementert i alle forskningsinstitusjon utfører delvis pancreatectomies, og dermed øke tilgangen til menneskelig holme materiale fra både ikke-diabetikere og type 2 diabetes pasienter. Dette er spesielt relevant gitt sparsommelige pancreata tilbys for holmen isolasjon. Gunstige aspekter LMD sammenlignet holme isoleri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke alle våre kolleger som bidro med hjelp, råd og kritisk innspill i forskjellige trinn i dette prosjektet. Produksjon av denne videoen artikkelen ble støttet med midler fra IMIDIA ( http://www.imidia.org ), den tyske departementet for utdanning og forskning (BMBF) til den tyske senter for Diabetes Research (DZD, http://www.dzd -ev.de ) og Universitetssykehuset Carl Gustav Carus ved University of Technology Dresden. Arbeidet fører til denne publikasjonen har fått støtte fra Innovative Medicines Initiative Joint Undertaking henhold tilskuddsavtalen n ° 155005 (IMIDIA), ressurser som er sammensatt av økonomiske bidrag fra EUs sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) og EFPIA selskapers tingsinnskudd.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22×22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
- Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).
