Förbättrad protokoll för laser mikrodissektion av humana pankreasöar från kirurgiska prover
Summary
Laser mikrodissektion är en teknik som gör det möjligt att återvinna utvalda celler från små mängder av parenkym. Här beskriver vi ett protokoll för att förvärva mänskliga pankreasöar från kirurgiska prover som skall användas för transcriptomic studier. Vår protokoll förbättrar inneboende autofluorescens av humana betaceller, vilket underlättar deras samling.
Abstract
Laser mikrodissektion (LMD) är en teknik som gör det möjligt att återvinna markerade celler och vävnader från små mängder av parenkymet 1,2. De dissekerade celler kan användas för en mängd olika undersökningar, såsom transcriptomic eller proteomik studier, DNA bedömning eller kromosomanalys 2,3. En särskilt utmanande tillämpning av LMD är transkriptom analys, vilket, beroende på labiliteten hos RNA 4, kan vara särskilt framträdande när cellerna dissekeras från vävnader som är rika av RNaser, såsom bukspottkörteln. En mikrodissektion protokoll som möjliggör snabb identifiering och insamling av målceller är viktigt i den här inställningen för att förkorta tiden vävnad hantering och därmed för att säkerställa RNA-bevarande.
Här beskriver vi ett protokoll för att förvärva mänskliga betaceller i bukspottkörteln från kirurgiska prover som skall användas för transcriptomic studier 5. Små bitar av pankreas av ca 0,5-1 cm 3 skars från de friska visas marginaler resekterade pankreas exemplar, inbäddade i Tissue-Tek OCT-förening, frystes omedelbart i kyld 2-metylbutan, och lagrades vid -80 ° C tills snittning. Fyrtio seriella sektioner av 10 | im tjocklek skars på en kryostat enligt en -20 ° C inställning, överförs individuellt till objektglas, torkades inuti kryostaten i 1-2 minuter, och lagrades vid -80 ° C.
Omedelbart före laser mikrodissektion förfarandet har sektioner fixerades i iskall, nyberedd 70% etanol under 30 sekunder, tvättas med 5-6 dopp i iskall DEPC-behandlat vatten och avvattnas genom två en minut inkubationer i iskall 100% etanol följt av xylen (som används för vävnad dehydratisering) under 4 min, vävnadssnitt var därefter lufttorkades därefter under 3-5 minuter. Viktigt är alla steg utom inkubation i xylen, utfördes med användning av iskalla reagens – en modifiering över en tidigare beskrivna protokoll 6. Utilization iskall reagens resulterade i en markant ökning av den inneboende autofluorescens av betaceller, och underlättade deras erkännande. För mikrodissektion var fyra sektioner uttorkad varje gång: två placerades i en folie-inslaget 50 ml tub, för att skydda vävnaden mot fukt och blekning, resterande två var omedelbart microdissected. Detta förfarande utfördes med hjälp av en PALM Microbeam instrument (Zeiss) användning av tryck Auto Laser Catapulting (AutoLPC) läge. Slutförandet av betaceller / holme dissektion från fyra kryosnitt krävs längre än 40-60 minuter. Celler uppsamlades i en AdhesiveCap och lyserades med 10 | il lysbuffert. Varje enskild RNA prov för transcriptomic analys erhölls genom att kombinera 10 cell microdissected prover, följt av RNA-extraktion med Pico Ren RNA Isolation Kit (Arcturus). Detta protokoll förbättrar inneboende autofluorescens av humana betaceller, vilket underlättar deras snabba och korrekta erkännande och collection. Ytterligare förbättringar av detta förfarande kan möjliggöra dissektion av fenotypiskt olika betacellerna, med eventuella konsekvenser för bättre förståelse av förändringar i samband med typ 2-diabetes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en pålitlig metod för laser mikrodissektion (LMD) mänskliga öar från kirurgisk bukspottkörteln prov. Förutsatt att en ljusmätare mikroskop är tillgängligt, kan detta förfarande genomföras på varje forskningsinstitution utför partiella pancreatectomies och därmed öka tillgången till mänskliga holme material från både icke-diabetiker och typ 2 diabetiker. Detta är särskilt relevant med tanke på bristen på pankreata erbjuds för holme isolering. Gynnsamma aspekter LMD jämfört med ö i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka alla våra kolleger som tillhandahålls hjälp, råd och kritisk ingång vid olika steg i detta projekt. Produktion av den här videon artikel stöddes med medel från IMIDIA ( http://www.imidia.org ), det tyska ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) till den tyska Centrum för diabetesforskning (DZD, http://www.dzd -ev.de ) och Universitetssjukhuset Carl Gustav Carus vid Tekniska högskolan Dresden. Arbetet ledde till denna publikation har fått stöd från initiativet för innovativa läkemedel gemensamt företag enligt bidragsavtal nr 155.005 (IMIDIA), resurser som består av ekonomiska bidrag från EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) och EFPIA företagens "i natura.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 2-Methylbutane (isopentane) | ROTH | 3927.1 | |
| AdhesiveCap (opaque, 500 μl) | ZEISS | 415190-9201-000 | |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 210 261 | with support skirt |
| Cellstar Tubes (50 ml) | greiner bio-one | 227.261 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | SIGMA | D 5758 | |
| Dry ice | |||
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Paint brush | |||
| PALM MicroBeam | ZEISS | ||
| Peel-a-Way embedding moulds (truncated), 12 x 12 mm | ProSciTech | RR12 | Top internal 22×22 mm, depth 21 mm |
| Arcturus PicoPure Frozen RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT 0204 | |
| Plastic clamp | |||
| Razor | |||
| RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
| RNaseZAP | SIGMA | R 2020 | |
| Scalpel / surgical blade | Techno Cut | 2800111 | |
| SuperFrost Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | 25x75x1.0 mm |
| Tissue-Tek O.C.T Compound | Sakura | 4583 or 0807000022 | |
| Tweezers | BRAUN | BD168R | |
| Xylene | VWR | 28975.291 |
References
- Bonner, R. F., Emmert-Buck, M., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Suarez-Quian, C. A., Goldstein, S. R., et al. Laser capture microdissection of single cells from complex tissues. Biotechniques. 26 (2), 328-3235 (1999).
- Espina, V., Wulfkuhle, J. D., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Mikulowska-Mennis, A., Taylor, T. B., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Bötticher, G., Sturm, D., Ehehalt, F., Knoch, K. P., Kersting, S., Grützmann, R., et al. Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients. J. Vis. Exp. (53), e2962 (2011).
- Marselli, L., Sgroi, D. C., et al. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
- Marselli, L., Thorne, J., et al. Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 93, 1046-1053 (2008).
- Bottino, R., Balamurugan, A. N., et al. Response of human islets to isolation stress and the effect of antioxidant treatment. Diabetes. 53 (10), 2559-2568 (2004).
- Abdelli, S., Ansite, J., et al. Intracellular stress signaling pathways activated during human islet preparation and following acute cytokine exposure. Diabetes. 53 (11), 2815-2823 (2004).
- Negi, S., Jetha, A., et al. Analysis of beta-cell gene expression reveals inflammatory signaling and evidence of dedifferentiation following human islet isolation and culture. PLoS One. 7 (1), e30415 (2012).
