Summary
Vestibulær schwannomas (VSS) er ikke-maligne tumorer af Schwann celle (SC) oprindelse, der er forbundet med mutationer i NF2 tumorsuppressorgenet. Vi rapporterer en reproducerbar, effektiv protokol til primære humane VS cellekultur, der giver mulighed for molekylære og cellulære eksperimentel manipulation og analyse og samler op heterogene karakter af sygdom hos mennesker.
Abstract
Vestibulære schwannomas (VSS) udgør Schwann celle (SC) tumorer i det vestibulære nerve, det går 10% af alle intrakranielle neoplasmer. VSS forekomme i enten sporadiske eller familiær (neurofibromatosis type 2, NF2) former, både i forbindelse med inaktivering defekter i NF2 tumorsuppressor gen. Behandling for VSS er generelt kirurgisk resektion eller strålebehandling, men sygelighed af sådanne procedurer har drevet undersøgelser mindre invasive behandlinger. Historisk set har manglende adgang til friske vævsprøver og det faktum, at schwannoma cellerne ikke udødeliggjort hæmmet brugen af primære kulturer til undersøgelse af schwannoma tumorigenese. For at overvinde den begrænsede forsyning af primære kulturer blev udødeliggjort HEI193 VS cellelinje genereret ved transduktion med HPV E6-og E7 oncogener. Denne onkogen transduktion indført væsentlige molekylære og fænotypiske ændringer i de celler, der begrænser deres anvendelse som model for humane schwannoma tumorer. Vi illustrerer derfor en forenklet, reproducerbar protokol til dyrkning af primære humane VS celler. Denne nemt mestrer teknik gør det muligt for molekylære og cellulære undersøgelser, der mere præcist rekapitulere kompleksiteten af VS sygdom.
Introduction
Vestibulære schwannomas (VSS) udgør Schwann celle (SC) tumorer i det vestibulære nerve, det går 10% af alle intrakranielle neoplasmer 1-3. VSS forekomme i enten sporadiske eller familiær (neurofibromatosis type 2, NF2) former, både i forbindelse med inaktivering defekter i NF2 tumorsuppressor gen. Behandling for VSS er generelt kirurgisk resektion eller strålebehandling, men sygelighed af sådanne procedurer inkluderer døvhed, ansigts neuropatier, lækage spinal, ubalance og tumorgenvækst 1. Derudover ikke alle patienter er acceptable kirurgisk eller stråling kandidater. En sådan betydelig sygelighed samt en mangel på alternative behandlingsformer har drevet undersøgelse af unikke molekylærbiologi VSS i håb om at udvikle nye behandlinger 3,4.
Celledyrkning giver mulighed for hurtig, letkøbt og dybtgående analyse af molekylære og cellulære adfærd og screening af potentielle terapeutiske compounds. Historisk set har manglende adgang til friske vævsprøver og det faktum, at schwannoma cellerne ikke udødeliggjort hæmmet brugen af primære kulturer til undersøgelse af schwannoma tumorigenese. For at overvinde det begrænsede udbud af primære kulturer, blev udødeliggjort HEI193 VS cellelinje genereret af transduktion med HPV E6 og E7 onkogener 5. Denne onkogen transduktion indført væsentlige molekylære og fænotypiske ændringer i de celler, der begrænser deres anvendelse som model for humane schwannoma tumorer. SC kulturer afledt fra transgene mus linjer, der mangler et funktionelt NF2 gen udgør et alternativ til at undersøge NF2-afhængig SC tumorigenese in vitro. Disse kulturer dog undlader at rekapitulere den heterogene karakter af menneskelig VSS eller konto for menneskelig bestemt adfærd. De fleste tidligere VS dyrkningsteknikker kræves relativt lange sagsbehandlingstider og komplicerede selektive dyrkningsteknikker 6-8.Her præsenterer vi en simpel, reproducerbar protokol til primær VS cellekultur med komplet behandling i under 3 timer, med 95% tumor celle renhed som bestemt ved immunfarvning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historie af in vitro Schwannoma Cultures
Bestræbelser på at etablere in vitro schwannoma kulturer begyndte blot et par årtier efter den indledende akustiske neuroma åben kirurgisk resektion forekom i 1894 12. Den første registrerede kulturer var ved Kredel i 1920'erne, der forgæves har forsøgt at vokse hakket tumor med "hængende dråbe-metoden" 12 . Senere, Drs. Murray og Stout offentliggjort deres in vitro-dy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Support: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100mm Round Culture Dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4 well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8 well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction Filter Flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small Scissor | FST | 14058-11 | |
| Small Forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel Handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel Blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological Pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated Ice Cooler | |||
| Culture Hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine Insulin (1mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T. Neurofibromatosis type 2. Adv Otorhinolaryngol. 70, 91-98 (2001).
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al. Experimental neurinoma in tissue culture. Acta Neuropathol. 21 (2), 154-164 (1972).
- Kaasinen, S., et al. Culturing of acoustic neuroma–methodological aspects. Acta Otolaryngol Suppl. 520 Pt 1, 25-26 (1995).
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd, , et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
