Culture primaire de l'homme vestibulaire schwannomes

Summary

Vestibulaire schwannomes (VSS) sont des tumeurs non malignes de cellules de Schwann (SC) origine, associées à des mutations dans le gène suppresseur de tumeur NF2. Nous rapportons, un protocole efficace et reproductible pour l'homme primaire VS culture cellulaire qui permet la manipulation et l'analyse expérimentale moléculaire et cellulaire et récapitule la nature hétérogène de la maladie humaine.

Abstract

Schwannomes vestibulaires (VSS) représentent cellules de Schwann (SC) des tumeurs du nerf vestibulaire, compromettre 10% de toutes les tumeurs intracrâniennes. Commutateurs virtuels se produisent dans (la neurofibromatose de type 2, NF2) soit formes sporadiques ou familiales, à la fois liés à des défauts d'inactivation du gène suppresseur de tumeur NF2 gène. Le traitement de VSS est généralement la résection chirurgicale ou la radiochirurgie, mais la morbidité de ces procédures a conduit des enquêtes sur des traitements moins invasifs. Historiquement, le manque d'accès à des échantillons de tissus frais et le fait que les cellules ne sont pas schwannome immortalisées ont considérablement entravé l'utilisation de cultures primaires d'enquête de schwannome tumorigenèse. Pour remédier à la quantité limitée de cultures primaires, la lignée cellulaire immortalisée HEI193 VS a été générée par transduction avec le HPV oncogènes E6 et E7. Cette transduction oncogène introduit altérations moléculaires et phénotypiques importantes pour les cellules, ce qui limite leur utilisation comme un modèle pour s humainestumeurs du chwannoma. Nous illustrons donc un protocole reproductible simplifiée pour la culture de cellules primaires humaines VS. Cette technique facile à maîtriser permet enquêtes moléculaires et cellulaires qui récapitulent plus précisément de la complexité de la maladie VS.

Introduction

Schwannomes vestibulaires (VSS) représentent cellules de Schwann (SC) des tumeurs du nerf vestibulaire, compromettre 10% de toutes les tumeurs intracrâniennes ^1-3. Commutateurs virtuels se produisent dans (la neurofibromatose de type 2, NF2) soit formes sporadiques ou familiales, à la fois liés à des défauts d'inactivation du gène suppresseur de tumeur NF2 gène. Le traitement de VSS est généralement la résection chirurgicale ou la radiochirurgie, mais la morbidité de ces procédures comprend la surdité, les neuropathies faciales, fuite de liquide céphalo-rachidien, le déséquilibre, et la repousse de la tumeur ^1. En outre tous les patients sont candidats à la chirurgie ou de radiothérapie acceptables. Cette morbidité ainsi que le manque de thérapies alternatives a conduit une enquête sur la biologie moléculaire unique de commutateurs virtuels dans l'espoir de développer de nouveaux traitements ^3,4.

La culture cellulaire permet une analyse rapide, facile, et en profondeur du comportement et de criblage moléculaire et cellulaire de com thérapeutique potentiellelivres. Historiquement, le manque d'accès à des échantillons de tissus frais et le fait que les cellules ne sont pas schwannome immortalisées ont considérablement entravé l'utilisation de cultures primaires d'enquête de schwannome tumorigenèse. Pour remédier à la quantité limitée de cultures primaires, la lignée cellulaire immortalisée HEI193 VS a été générée par transduction avec E6 et E7 de HPV oncogènes ^5. Cette transduction oncogène introduit altérations moléculaires et phénotypiques importantes pour les cellules, ce qui limite leur utilisation comme un modèle pour les tumeurs de schwannome humaines. cultures SC issus de lignées de souris transgéniques qui n'ont pas un gène NF2 fonctionnelle représentent une autre alternative pour enquêter NF2 dépendant tumorigenèse SC in vitro. Ces cultures mais ne parviennent pas à récapituler la nature hétérogène des commutateurs virtuels humain ou d'un compte d'un comportement humain spécifique. La plupart des techniques antérieures de culture VS tenus temps de traitement relativement longs et les techniques de culture sélective complexes ^6-8.Nous présentons ici un protocole simple, reproductible pour principal VS culture cellulaire avec un traitement complet en moins de 3 heures, avec 95% de pureté des cellules tumorales tel que déterminé par immunomarquage.

Protocol

Déclaration d'éthique: l'utilisation des échantillons de tumeurs humaines dans ce protocole a été approuvé par l'Université de l'Iowa Institutional Review Board (IRB). 1. Configuration du jour d'avant tumeur récolte Culture Manteau cellulaires Plaques: Dans une hotte de culture stérile, ajouter suffisamment de poly-L-ornithine (0,01% solution) pour couvrir le fond d'une culture polystyrène / plastique et / plat, remplacer les couvercles et laisser…

Representative Results

Fragmentation de la tumeur correct est essentiel pour l'ensemencement optimal et l'excroissance dans des boîtes de culture de tissus (figure 1). Identification des cellules de schwannome pendant les premiers jours après placage est souvent difficile, en raison d'obscurcir quantités de débris cellulaires et des globules rouges. Par la 4 e ou 5 e jour, les extensions de cellules proches des fragments de tumeur adhérentes vont créer reconnaissable "laçage"…

Discussion

Histoire de cultures in vitro dans Schwannome

Les efforts visant à établir dans les cultures de schwannome in vitro ont commencé quelques décennies après la neurinome de l'acoustique initiale résection chirurgicale ouverte a eu lieu en 1894 ^12. Les premières cultures enregistrées étaient par Kredel dans les années 1920, qui a tenté en vain de se développer tumeur hachée par "méthode de la goutte suspendue" <su…

Materials

Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100mm Round Culture Dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4 well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8 well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction Filter Flask	Midwest Scientific	TP99500
15ml Conical Tube	Midwest Scientific	TP91015
50ml Conical Tube	Midwest Scientific	TP91050
2mL Round Bottom Tube	USA Scientific	1620-2700
Small Scissor	FST	14058-11
Small Forceps	FST	11251-20
Scalpel Handle	FST	10004-13
#11 Scalpel Blade	Roboz	RS-9801-11
Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological Pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated Ice Cooler
Culture Hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 Supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin – Streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine Insulin (1mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components