人間の前庭神経鞘腫の初代培養

Summary

前庭神経鞘腫（VSS）がNF2腫瘍抑制遺伝子における変異に関連するシュワン細胞（SC）由来の非悪性腫瘍である。私たちは、分子や細胞の実験操作および分析を可能にし、ヒトの疾患の不均一な性質を再現細胞培養VS初代ヒトのための再現可能な、効率的なプロトコルを報告します。

Abstract

前庭神経鞘腫（VSS）は、全ての頭蓋内新生物の10パーセントを損なう、前庭神経のシュワン細胞（SC）の腫瘍を表​​す。 VSSは、両方のNF2腫瘍抑制における不活性化の欠陥に関連する散発性または家族のどちらか（神経線維腫症2型、NF2）の形態で起こる 遺伝子。 、VSSの治療は、しかし、このような手順の罹患率は、低侵襲治療法の調査を推進してきました、一般的には外科的切除や放射線手術である。歴史的に、新鮮な組織試料へのアクセスの欠如、および神経鞘腫細胞は不死化されていないという事実は、有意に神経鞘腫の腫瘍形成の調査のための一次培養物の使用を妨げている。一次培養物の限られた供給を克服するために、不死化VS HEI193細胞株は、HPV E6およびE7癌遺伝子による形質導入により作製した。この発癌性形質導入は、人間のためのモデルとしてのそれらの使用を制限する細胞に重要な分子および表現型変化を導入chwannoma腫瘍。そこで我々は、細胞のVS初代ヒトの培養のための単純化され、再現性のあるプロトコルを示しています。この簡単に習得技術は、より正確に、VS疾患の複雑さを再現分子や細胞の研究が可能になります。

Introduction

前庭神経鞘腫（VSS）は、全ての頭蓋内新生物は^1-3の10％を犠牲にすること、前庭神経のシュワン細胞（SC）の腫瘍を表す。 VSSは、両方のNF2腫瘍抑制における不活性化の欠陥に関連する散発性または家族のどちらか（神経線維腫症2型、NF2）の形態で起こる 遺伝子。のVSの治療は、しかし、このような手順の罹患率は、難聴、顔面神経障害、脊髄液漏出、不均衡、および腫瘍の再増殖¹と、一般的に外科的切除または放射線手術である。さらに、すべての患者が許容できる外科的または放射線の候補ではない。このような重大な病的状態だけでなく、代替療法がないことは、新たな治療^の3,4の開発を期待してのVSのユニークな分子生物学の調査を推進してきました。

細胞培養は、潜在的な治療COMの分子や細胞の挙動やスクリーニング、迅速な容易、かつ詳細な分析が可能にポンド。歴史的に、新鮮な組織試料へのアクセスの欠如、および神経鞘腫細胞は不死化されていないという事実は、有意に神経鞘腫の腫瘍形成の調査のための一次培養物の使用を妨げている。一次培養物の限られた供給を克服するために、不死化VS HEI193細胞株は、HPV E6およびE7癌遺伝子⁵で形質導入によって生成した。この発癌性形質導入は、人間の神経鞘腫のモデルとしてそれらの使用を制限する細胞に重要な分子および表現型の変化を導入しました。官能NF2遺伝子を欠いているトランスジェニックマウス系統由来SC培養物は、 インビトロでNF2依存SC腫瘍形成を調査する別の代替を表す。これらの培養物は、しかし、人間の特定の動作のために、人間のVSSまたはアカウントの不均一な性質を再現することができない。ほとんどの前のVS培養技術は、比較的長い処理時間及び複雑な選択的な培養技術^6-8を必要と^した。ここでは、免疫染色によって決定された95％の腫瘍細胞の純度で、3時間の下に完全に処理した細胞培養VS原発のための簡単​​な、再現性のあるプロトコルを提示する。

Protocol

倫理声明：このプロトコルでのヒト腫瘍標本の使用は、アイオワ大学施設内倫理委員会（IRB）により承認された。 1。セットアップ腫瘍収穫前日コー​​ト細胞培養プレート：無菌培養フードにおいては、蓋を交換し、ポリスチレン/プラスチック培養ウェル/皿の底を覆うのに十分なポリ-L-オルニチン（0.01％溶液）を添加し、少なくとも室温で放置2時間。ガラス?…

Representative Results

正しい腫瘍の断片化は、組織培養皿で播種し、最適な成長（ 図1）に必須である。めっき後の最初の日の間に神経鞘腫細胞の同定は、細胞残屑および赤血球の量を不明瞭に、しばしば困難である。 4 回目か5 日目では、付着性の腫瘍断片近いセルの拡張機能は、残骸の中からパターンを「レーシング」に認識が作成されます。その後のメディアの変更は、一般的に…

Discussion

in vitroでの神経鞘腫の文化の歴史

体外神経鞘腫培養で確立するための努力は、最初の聴神経腫のオープン外科的切除は1894 ¹²に発生したわずか数十年後に始まった。最初に記録文化が1920年代にKredelであったが、失敗した「ハンギングドロップ法^」12に刻まれた腫瘍を成長しようとした人。その後、博士。マレーとスタウト…

Materials

Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100mm Round Culture Dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4 well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8 well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction Filter Flask	Midwest Scientific	TP99500
15ml Conical Tube	Midwest Scientific	TP91015
50ml Conical Tube	Midwest Scientific	TP91050
2mL Round Bottom Tube	USA Scientific	1620-2700
Small Scissor	FST	14058-11
Small Forceps	FST	11251-20
Scalpel Handle	FST	10004-13
#11 Scalpel Blade	Roboz	RS-9801-11
Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological Pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated Ice Cooler
Culture Hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 Supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin – Streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine Insulin (1mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components