Cultura primario di Human vestibolare Schwannomi
Summary
Vestibolare Schwannomi (VSS) sono tumori non maligni della cella (SC) di origine Schwann, associati a mutazioni del NF2 gene soppressore del tumore. Riportiamo un protocollo efficace e riproducibile per uso umano primario VS coltura cellulare che permette di manipolazione sperimentale molecolare e cellulare e di analisi e ricapitola la natura eterogenea delle malattie umane.
Abstract
Schwannoma vestibolare (VSS) rappresentano cellule di Schwann (SC) i tumori del nervo vestibolare, compromettendo il 10% di tutte le neoplasie intracraniche. Vss verifica in (neurofibromatosi di tipo 2, NF2) forma sporadica o familiare, entrambe associate a difetti inattivazione nel tumore soppressore NF2 gene. Il trattamento per VSS è generalmente la resezione chirurgica o la radiochirurgia, ma la morbosità di tali procedure ha spinto indagini trattamenti meno invasivi. Storicamente, la mancanza di accesso ai campioni di tessuto fresco e il fatto che le cellule schwannoma non sono immortalati hanno ostacolato in modo significativo l'uso di colture primarie per le indagini di schwannoma tumorigenesi. Per superare la limitata offerta di colture primarie, la linea cellulare HEI193 VS immortalata è stato generato da trasduzione con HPV oncogeni E6 ed E7. Questo trasduzione oncogenica introdotto significative alterazioni molecolari e fenotipici alle cellule, che limitano il loro uso come modello per s umanitumori chwannoma. Abbiamo quindi illustrare un protocollo riproducibile semplificata per cultura umana primaria VS cellule. Questa tecnica permette facilmente masterizzato per indagini molecolari e cellulari che ricapitolano più accuratamente la complessità della malattia VS.
Introduction
Schwannoma vestibolare (VSS) rappresentano cellule di Schwann (SC) i tumori del nervo vestibolare, compromettendo il 10% di tutte le neoplasie intracraniche 1-3. Vss verifica in (neurofibromatosi di tipo 2, NF2) forma sporadica o familiare, entrambe associate a difetti inattivazione nel tumore soppressore NF2 gene. Il trattamento per VSS è generalmente la resezione chirurgica o la radiochirurgia, ma la morbosità di tali procedure comprende sordità, neuropatie del viso, perdita di liquido spinale, squilibrio, e la ricrescita del tumore 1. Inoltre, non tutti i pazienti sono candidati per la chirurgia o radiazioni accettabili. Tale significativa morbilità, nonché una mancanza di terapie alternative ha spinto indagine sulla biologia molecolare unico di VSS nella speranza di sviluppare nuovi trattamenti 3,4.
Coltura cellulare permette una rapida, facile, e approfondita analisi del comportamento molecolare e cellulare e lo screening del potenziale terapeutico comsterline. Storicamente, la mancanza di accesso ai campioni di tessuto fresco e il fatto che le cellule schwannoma non sono immortalati hanno ostacolato in modo significativo l'uso di colture primarie per le indagini di schwannoma tumorigenesi. Per superare la limitata offerta di colture primarie, la linea cellulare HEI193 VS immortalata è stato generato da trasduzione con HPV oncogeni E6 ed E7 5. Questo trasduzione oncogenica introdotto significative alterazioni molecolari e fenotipici alle cellule, che ne limitano l'uso come modello per i tumori schwannoma umani. Culture SC derivate da linee di topi transgenici che mancano di un gene NF2 funzionale rappresentano un'altra alternativa per indagare NF2-dipendente tumorigenesi SC in vitro. Queste culture però non riescono a riepilogare la natura eterogenea del Vss umano o di un conto per il comportamento umano specifico. La maggior parte delle precedenti tecniche di coltura VS richiesti tempi relativamente lunghi di lavorazione e complicate tecniche di coltura selettivi 6-8.Qui vi presentiamo un protocollo semplice e riproducibile per primario VS coltura cellulare con l'elaborazione completa in meno di 3 ore, con il 95% di purezza delle cellule tumorali come determinato da immunoistochimica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Storia delle culture in vitro schwannoma a
Sforzi per stabilire in colture in vitro schwannoma iniziato solo pochi decenni dopo la neuroma acustico iniziale resezione chirurgica aperta si è verificato nel 1894 12. Le prime colture registrate erano di Kredel nel 1920, che hanno tentato senza successo di crescita del tumore macinate dal "metodo goccia appeso" 12 . Più tardi, Drs. Murray e Stout pubblicato la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supporto: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100mm Round Culture Dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4 well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8 well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction Filter Flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small Scissor | FST | 14058-11 | |
| Small Forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel Handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel Blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological Pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated Ice Cooler | |||
| Culture Hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine Insulin (1mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
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