Cultura primária de Vestibular Humano Schwanomas

Summary

Schwannomas vestibulares (VSS) são tumores não-malignos de células de Schwann (SC), origem associados com mutações no gene supressor de tumores de NF2. Apresentamos um protocolo reprodutível e eficiente para humano primário VS cultura celular que permite a manipulação experimental celular e molecular e análise e recapitula a heterogeneidade da doença humana.

Abstract

Schwannomas vestibulares (VSS) representam Schwann célula (SC) tumores do nervo vestibular, comprometendo 10% de todas as neoplasias intracranianas. VSes ocorrer na neurofibromatose tipo 2 (NF2), formas ou esporádica ou familiar, tanto associados inativando defeitos no supressor de tumor NF2 gene. Tratamento para VSS é geralmente a ressecção cirúrgica ou radiocirurgia, porém a morbidade desses procedimentos tem conduzido investigações sobre tratamentos menos invasivos. Historicamente, a falta de acesso a amostras de tecido fresco e ao fato de que as células schwannoma não são imortalizadas têm dificultado significativamente o uso de culturas primárias para a investigação de schwannoma tumorigênese. Para superar o fornecimento restrito de culturas primárias, a linha celular imortalizada HEI193 VS foi gerado através de transdução com o HPV E6 e E7 de oncogenes. Este transdução oncogénica introduzido alterações moleculares e fenotípicas significativas para as células, o que limita a sua utilização como um modelo para es humanostumores chwannoma. Nós, portanto, ilustrar um protocolo simplificado, reprodutível para a cultura do ser humano primário VS células. Esta técnica permite facilmente dominado investigações moleculares e celulares que recapitulam com mais precisão a complexidade da doença VS.

Introduction

Schwannomas vestibulares (VSS) representam Schwann célula (SC) tumores do nervo vestibular, comprometendo 10% de todas as neoplasias intracranianas ^1-3. VSes ocorrer na neurofibromatose tipo 2 (NF2), formas ou esporádica ou familiar, tanto associados inativando defeitos no supressor de tumor NF2 gene. Tratamento para VSS é geralmente a ressecção cirúrgica ou radiocirurgia, no entanto, a morbidade de tais procedimentos incluem surdez, neuropatias faciais, vazamento de fluido espinhal, desequilíbrio, e rebrota tumor ^1. Além disso nem todos os pacientes são aceitáveis ​​candidatos à cirurgia ou radioterapia. Tal morbidade significativa, bem como a falta de terapias alternativas tem impulsionado a investigação sobre a biologia molecular única de VSes na esperança de desenvolver novos tratamentos ^3,4.

Cultura celular permite a análise rápida, fácil, e em profundidade do comportamento molecular e celular e de triagem do potencial terapêutico comlibras. Historicamente, a falta de acesso a amostras de tecido fresco e ao fato de que as células schwannoma não são imortalizadas têm dificultado significativamente o uso de culturas primárias para a investigação de schwannoma tumorigênese. Para superar o fornecimento restrito de culturas primárias, a linha celular imortalizada HEI193 VS foi gerado através de transdução com o HPV E6 e E7 oncogenes ^5. Este transdução oncogénica introduzido alterações moleculares e fenotípicas significativas para as células, o que limita a sua utilização como um modelo para tumores schwannoma humanos. Culturas SC derivados de linhas de camundongos transgênicos que não possuem um gene NF2 funcional representam uma outra alternativa para investigar tumorigenesis SC NF2-dependente in vitro. Estas culturas no entanto deixar de recapitular a heterogeneidade dos VSes humano ou conta para o comportamento específico humano. A maioria das técnicas anteriores de cultura VS necessário tempos de processamento relativamente longas e complicadas técnicas de cultura seletivos ^6-8.Aqui apresentamos um protocolo simples e reprodutível para a primária VS cultura de células com processamento completo em menos de 3 horas, com 95% de pureza das células tumorais, como determinado por imunocoloração.

Protocol

Declaração de Ética: Uso dos espécimes tumorais humanas neste protocolo foi aprovado pela Universidade de Iowa Institutional Review Board (IRB). 1. Setup no dia anterior Tumor Colheita Placas de cultura de células: casaco Num capuz de cultura estéril, adicionar suficiente poli-L-ornitina (solução a 0,01%) para cobrir o fundo de uma cultura de poliestireno / poço de plástico / prato, substituir as tampas, e deixar repousar à temperatura ambiente durante pelo menos 2 hr. …

Representative Results

Fragmentação tumor correcta é essencial para a propagação óptima e excrescência em pratos de cultura de tecidos (Figura 1). Identificação de células de schwannoma, durante os primeiros dias após o revestimento é muitas vezes difícil, devido ao obscurecimento quantidades de detritos celulares e as células vermelhas do sangue. Até o 4 º ou 5 º dia, extensões celulares perto de fragmentos tumorais aderentes criará reconhecível 'laçar' padrões entre os esc…

Discussion

História das culturas in vitro Schwannoma

Esforços para estabelecer em culturas in vitro schwannoma começou apenas algumas décadas após o neuroma acústico inicial ressecção cirúrgica aberta ocorreu em 1894 ^12. As primeiras culturas foram gravadas por Kredel na década de 1920, que tentou em vão crescer tumor picada pelo "método da gota pendurado" ¹² . Mais tarde, os drs. Murray e Stout publicou sua experi?…

Materials

Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100mm Round Culture Dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4 well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8 well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction Filter Flask	Midwest Scientific	TP99500
15ml Conical Tube	Midwest Scientific	TP91015
50ml Conical Tube	Midwest Scientific	TP91050
2mL Round Bottom Tube	USA Scientific	1620-2700
Small Scissor	FST	14058-11
Small Forceps	FST	11251-20
Scalpel Handle	FST	10004-13
#11 Scalpel Blade	Roboz	RS-9801-11
Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological Pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated Ice Cooler
Culture Hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 Supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin – Streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine Insulin (1mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components