Cultivo primario de Human vestibular schwannomas

Summary

Vestibular schwannomas (VS) son tumores no malignos de células (SC) origen Schwann, asociadas a mutaciones en el gen supresor de tumores NF2. Se presenta un protocolo reproducible, eficiente para la enseñanza primaria humanos VS cultivo celular que permite la manipulación experimental molecular y celular y el análisis y recapitula la naturaleza heterogénea de la enfermedad humana.

Abstract

Schwannomas vestibulares (VSS) representan Schwann células (SC), los tumores del nervio vestibular, lo que compromete el 10% de todas las neoplasias intracraneales. VS ocurre en (neurofibromatosis tipo 2, NF2) formas ya sea esporádica o familiar, tanto asociados a defectos de inactivación del gen supresor tumoral NF2 gen. El tratamiento para la VS es generalmente la resección quirúrgica o radiocirugía, sin embargo, la morbilidad de estos procedimientos ha conducido investigaciones sobre los tratamientos menos invasivos. Históricamente, la falta de acceso a los especímenes de tejido fresco y el hecho de que las células no se inmortalizan schwannoma han obstaculizado significativamente el uso de cultivos primarios para la investigación de la tumorigénesis schwannoma. Para superar la limitada oferta de los cultivos primarios, la línea celular inmortalizada HEI193 VS se generó por transducción con VPH E6 y E7 oncogenes. Esta transducción oncogénico introdujo alteraciones moleculares y fenotípicos significativos a las células, que limitan su uso como un modelo para s humanostumores chwannoma. Por lo tanto, ilustramos un protocolo reproducible simplificado para la cultura de los derechos humanos primaria células VS. Esta técnica permite dominar fácilmente para investigaciones moleculares y celulares que recapitulan con más precisión la complejidad de la enfermedad de VS.

Introduction

Schwannomas vestibulares (VSS) representan Schwann células (SC), los tumores del nervio vestibular, lo que compromete el 10% de todas las neoplasias intracraneales ^1-3. VS ocurre en (neurofibromatosis tipo 2, NF2) formas ya sea esporádica o familiar, tanto asociados a defectos de inactivación del gen supresor tumoral NF2 gen. El tratamiento para la VS es generalmente la resección quirúrgica o radiocirugía, sin embargo, la morbilidad de estos procedimientos incluyen sordera, neuropatías faciales, fuga de líquido cefalorraquídeo, el desequilibrio, y el nuevo crecimiento del tumor ^1. Además no todos los pacientes son candidatos para la cirugía o la radiación aceptables. Tal morbilidad significativa, así como una falta de terapias alternativas ha impulsado la investigación en la biología molecular única de VS en la esperanza de desarrollar nuevos tratamientos de ^3,4.

El cultivo celular permite el análisis rápido, fácil, y en profundidad del comportamiento molecular y celular y la detección del potencial terapéutico comlibra. Históricamente, la falta de acceso a los especímenes de tejido fresco y el hecho de que las células no se inmortalizan schwannoma han obstaculizado significativamente el uso de cultivos primarios para la investigación de la tumorigénesis schwannoma. Para superar la limitada oferta de los cultivos primarios, la línea celular inmortalizada HEI193 VS se generó por transducción con VPH E6 y E7 oncogenes ^5. Esta transducción oncogénico introdujo alteraciones moleculares y fenotípicos significativos a las células, que limitan su uso como un modelo para los tumores schwannoma humanos. Culturas SC derivados de líneas de ratones transgénicos que carecen de un gen NF2 funcional representan otra alternativa para investigar la tumorigénesis SC NF2 in vitro dependiente. Estas culturas, sin embargo no pueden recapitular la naturaleza heterogénea de las VS humana o dar cuenta de la conducta humana específica. La mayoría de las técnicas anteriores cultura VS requieren tiempos de procesamiento relativamente largas y complicadas técnicas de cultivo selectivos ^6-8.Aquí se presenta un protocolo simple, reproducible para primaria VS cultivo celular con un proceso completo en menos de 3 horas, con un 95% de pureza de las células tumorales como se determina por inmunotinción.

Protocol

Declaración de Ética: el uso de las muestras de tumores humanos en este protocolo fue aprobado por la Universidad de Iowa Junta de Revisión Institucional (IRB). 1. Configuración del día de antes de la cosecha del tumor Placas de cultivo Escudo celulares: En una campana de cultivo estéril, añadir una cantidad suficiente (solución al 0,01%) de poli-L-ornitina para cubrir el fondo de una cultura de poliestireno / plástico y / plato, reemplace las tapas, y deje reposar a temp…

Representative Results

La fragmentación del tumor correcta es esencial para la siembra óptima y el crecimiento en las placas de cultivo de tejido (Figura 1). Identificación de células schwannoma durante los primeros días después de la siembra es a menudo difícil, debido a oscurecer cantidades de residuos celulares y las células rojas de la sangre. Por el 4 º o 5 º día, las extensiones celulares cerca de fragmentos tumorales adherentes crearán reconocible 'cordón' patrones entre los e…

Discussion

Historia de cultivos in vitro Schwannoma

Los esfuerzos por establecer en cultivos in vitro schwannoma comenzaron tan sólo unas décadas después de que el neuroma acústico inicial resección quirúrgica abierta se produjo en 1894 ^12. Los primeros cultivos fueron grabadas por Kredel en la década de 1920, que intentó sin éxito para crecer tumor triturado por "método de la gota colgante" ¹² . Más tarde, los Dres….

Materials

Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100mm Round Culture Dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4 well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8 well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction Filter Flask	Midwest Scientific	TP99500
15ml Conical Tube	Midwest Scientific	TP91015
50ml Conical Tube	Midwest Scientific	TP91050
2mL Round Bottom Tube	USA Scientific	1620-2700
Small Scissor	FST	14058-11
Small Forceps	FST	11251-20
Scalpel Handle	FST	10004-13
#11 Scalpel Blade	Roboz	RS-9801-11
Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological Pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated Ice Cooler
Culture Hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 Supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin – Streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine Insulin (1mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components