Primäre Kultur der Menschen vestibuläre Schwannome
Summary
Vestibuläre Schwannome (VSS) nicht-malignen Tumoren von Schwann-Zellen (SC) Ursprungs, mit Mutationen im NF2 Tumorsuppressor-Gen assoziiert ist. Wir berichten über einen reproduzierbaren, effizienten Protokoll für primäre humane VS Zellkultur, die für die molekulare und zelluläre experimentelle Manipulation und Analyse ermöglicht und rekapituliert die heterogene Natur der menschlichen Krankheit.
Abstract
Vestibuläre Schwannome (VSS) stellen Schwann-Zellen (SC) Tumoren des Nervus vestibularis, Kompromisse 10% aller intrakraniellen Neoplasmen. VSs treten entweder sporadisch oder familiär (Neurofibromatose Typ 2, NF2) Formen, die beide mit Inaktivierung von Defekten in der NF2 Tumorsuppressor verbunden Gen. Die Behandlung ist in der Regel für VSS chirurgische Resektion oder Radiochirurgie, aber die Morbidität dieser Verfahren hat Ermittlungen in weniger invasive Behandlungen angetrieben. Historisch sind der fehlende Zugang zu frischen Gewebeproben und der Tatsache, dass Schwannom Zellen nicht verewigt deutlich die Verwendung von Primärkulturen zur Untersuchung der Tumorgenese Schwannom behindert. Um das begrenzte Angebot an Primärkulturen zu überwinden, wurde die verewigt HEI193 VS Zelllinie durch Transduktion mit HPV-Onkogene E6 und E7 erzeugt. Diese onkogene Transduktion eingeführt signifikanten molekularen und phänotypischen Veränderungen der Zellen, die ihre Verwendung als Modell für menschliche s begrenzenchwannoma Tumoren. Wir stellen daher eine vereinfachte, reproduzierbare Protokoll für die Kultur von primären humanen Zellen VS. Diese leicht zu beherrschen Technik ermöglicht molekularen und zellulären Untersuchungen, genauer rekapitulieren die Komplexität der VS Krankheit.
Introduction
Vestibuläre Schwannome (VSS) stellen Schwann-Zellen (SC) Tumoren des Nervus vestibularis, Kompromisse 10% aller intrakraniellen Neoplasmen 1-3. VSs treten entweder sporadisch oder familiär (Neurofibromatose Typ 2, NF2) Formen, die beide mit Inaktivierung von Defekten in der NF2 Tumorsuppressor verbunden Gen. Die Behandlung ist in der Regel für VSS chirurgische Resektion oder Radiochirurgie, aber die Morbidität dieser Verfahren beinhaltet Taubheit, Gesichts Neuropathien, Rückenmarksflüssigkeit auslaufen, Ungleichgewicht, und ein erneutes Tumorwachstum. Außerdem werden nicht alle Patienten sind akzeptabel chirurgischen oder strahlen Kandidaten. Solche erheblichen Morbidität sowie ein Mangel an alternativen Therapien hat die Untersuchung in die einzigartige molekulare Biologie der VSs in der Hoffnung, die Entwicklung neuer Behandlungen 3,4 angetrieben.
Zellkultur ermöglicht eine schnelle, einfache und gründliche Analyse der molekularen und zellulären Verhalten und Screening von potenziellen therapeutischen comPfund. Historisch sind der fehlende Zugang zu frischen Gewebeproben und der Tatsache, dass Schwannom Zellen nicht verewigt deutlich die Verwendung von Primärkulturen zur Untersuchung der Tumorgenese Schwannom behindert. Um das begrenzte Angebot an Primärkulturen zu überwinden, wurde die verewigt HEI193 VS Zelllinie durch Transduktion mit HPV-Onkogene E6 und E7 5 erzeugt. Diese onkogene Transduktion eingeführt signifikanten molekularen und phänotypischen Veränderungen der Zellen, die ihre Verwendung als Modell für menschliche Tumoren Schwannom begrenzen. SC Kulturen aus transgenen Mauslinien, die eine funktionelle NF2-Gen fehlt abgeleitet sind eine weitere Alternative zu NF2 abhängige SC Tumorgenese in vitro zu untersuchen. Diese Kulturen allerdings nicht die heterogene Natur der menschlichen VSs oder Konto für den menschlichen bestimmtes Verhalten zu rekapitulieren. Die meisten bisherigen VS Kulturtechniken benötigt relativ lange Bearbeitungszeiten und komplizierte selektiven Kulturtechniken 8.6.Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache, reproduzierbare Protokoll für VS primären Zellkultur mit Komplettbearbeitung in unter 3 Stunden, mit 95% Reinheit, wie Tumorzellen durch Immunfärbung bestimmt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geschichte der In-vitro-Kulturen Schwannom
Die Bemühungen um die In-vitro-Kulturen zu etablieren begann Schwannom weniger Jahrzehnte nach der ersten Akustikusneurinom offenen chirurgischen Resektion erfolgte im Jahre 1894 12. Die erste aufgezeichnete Kulturen waren von Kredel in den 1920er Jahren, der erfolglos versuchte, Hackfleisch Tumor durch "hanging drop-Methode" 12 wachsen . Später Drs. Murray und Stout veröffentlich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Support: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100mm Round Culture Dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4 well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8 well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction Filter Flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small Scissor | FST | 14058-11 | |
| Small Forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel Handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel Blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological Pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated Ice Cooler | |||
| Culture Hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine Insulin (1mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
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