Primaire cultuur van de mens Vestibular Schwannomen
Summary
Vestibulaire Schwannomas (VSS) niet-maligne tumoren van Schwann-cellen (SC) oorsprong, geassocieerd met mutaties in het NF2 tumor suppressor gen. Wij rapporteren een reproduceerbare, efficiënt protocol voor primaire menselijke VS celcultuur die het mogelijk maakt voor moleculaire en cellulaire experimentele manipulatie en analyse en recapituleert de heterogene aard van de ziekte bij de mens.
Abstract
Vestibulaire schwannomen (VSS) vertegenwoordigen Schwann-cellen (SC) tumoren van de vestibulaire zenuw, afbreuk te doen aan 10% van alle intracraniële tumoren. VSen zich ofwel sporadische of familiaire (neurofibromatose type 2, NF2) vormen, zowel in verband met het inactiveren van defecten in het NF2 tumor suppressor gen. Behandeling voor VSen is over het algemeen chirurgische resectie of radiochirurgie, maar de morbiditeit van deze procedures heeft onderzoek gedreven in minder invasieve behandelingen. Historisch gezien zijn gebrek aan toegang tot verse weefselmonsters en het feit dat schwannoma cellen niet worden vereeuwigd aanzienlijk bemoeilijkt het gebruik van primaire kweken voor onderzoek schwannoma het ontstaan van tumoren. Om het beperkte aanbod van primaire culturen te overwinnen, werd het vereeuwigd HEI193 VS cellijn gegenereerd door transductie met HPV E6 en E7 oncogenen. Deze oncogene transductie ingevoerd significante moleculaire en fenotypische veranderingen aan de cellen die het gebruik als een model voor humane grenswaardechwannoma tumoren. We illustreren dus een vereenvoudigde, reproduceerbare protocol voor cultuur van primaire menselijke cellen VS. Dit gemakkelijk onder de knie techniek maakt het mogelijk voor moleculaire en cellulaire onderzoeken die nauwkeuriger recapituleren de complexiteit van de ziekte VS.
Introduction
Vestibulaire schwannomen (VSS) vertegenwoordigen Schwann-cellen (SC) tumoren van de vestibulaire zenuw, afbreuk te doen aan 10% van alle intracraniële neoplasmata 1-3. VSen zich ofwel sporadische of familiaire (neurofibromatose type 2, NF2) vormen, zowel in verband met het inactiveren van defecten in het NF2 tumor suppressor gen. Behandeling voor VSen is over het algemeen chirurgische resectie of radiochirurgie, maar de morbiditeit van dergelijke procedures omvat doofheid, gezichts neuropathieën, weglekken van ruggenmergvloeistof, onbalans, en tumor hergroei 1. Bovendien niet alle patiënten zijn aanvaardbaar chirurgische of straling kandidaten. Dergelijke significante morbiditeit en een gebrek aan alternatieve therapieën heeft onderzoek gedreven in de unieke moleculaire biologie van VSen in de hoop op het ontwikkelen van nieuwe behandelingen 3,4.
Celcultuur zorgt voor een snelle, gemakkelijke en grondige analyse van de moleculaire en cellulaire gedrag en screening van potentiële therapeutische compond. Historisch gezien zijn gebrek aan toegang tot verse weefselmonsters en het feit dat schwannoma cellen niet worden vereeuwigd aanzienlijk bemoeilijkt het gebruik van primaire kweken voor onderzoek schwannoma het ontstaan van tumoren. Om het beperkte aanbod van primaire culturen te overwinnen, werd het vereeuwigd HEI193 VS cellijn gegenereerd door transductie met HPV E6 en E7 oncogenen 5. Deze oncogene transductie ingevoerd significante moleculaire en fenotypische veranderingen aan de cellen die het gebruik als een model voor humane schwannoma tumoren beperken. SC cultures afgeleid van transgene muizen lijnen die een functioneel gen missen NF2 vormen een alternatief voor NF2-afhankelijke SC tumorigenese in vitro onderzoeken. Deze culturen niet echter aan de heterogene aard van de menselijke VSen of account voor menselijke specifiek gedrag recapituleren. De meeste vorige VS cultuur technieken die nodig zijn relatief lange doorlooptijden en ingewikkeld selectieve kweektechnieken 6-8.Hier presenteren we een eenvoudige, reproduceerbare protocol voor primaire VS celkweek met volledige verwerking in minder dan 3 uur, met 95% tumorcel zuiverheid, zoals bepaald door immunostaining.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geschiedenis van de in vitro Schwannoom Cultures
Inspanningen om vast te stellen in vitro schwannoma culturen begon enkele decennia na de eerste akoestische neuroma open chirurgische resectie plaatsvond in 1894 12. De eerste geregistreerde culturen waren door Kredel in de jaren 1920, die tevergeefs probeerde om gehakt tumor groeien door "opknoping druppel methode" 12 . Later, Drs. Murray en Stout publiceerden hun in vitro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteuning: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100mm Round Culture Dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4 well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8 well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction Filter Flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small Scissor | FST | 14058-11 | |
| Small Forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel Handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel Blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological Pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated Ice Cooler | |||
| Culture Hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine Insulin (1mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T. Neurofibromatosis type 2. Adv Otorhinolaryngol. 70, 91-98 (2001).
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al. Experimental neurinoma in tissue culture. Acta Neuropathol. 21 (2), 154-164 (1972).
- Kaasinen, S., et al. Culturing of acoustic neuroma–methodological aspects. Acta Otolaryngol Suppl. 520 Pt 1, 25-26 (1995).
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd, , et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
