Primær Culture of Human Vestibulær schwannomas

Summary

Vestibulær schwannomas (VSS) er ikke-maligne svulster av Schwann celle (SC) opprinnelse, assosiert med mutasjoner i NF2 tumorsuppressorgen. Vi rapporterer en reproduserbar, effektiv protokoll til primære humane VS cellekultur som gjør det mulig for molekylær-og celle eksperimentell manipulering og analyse og sammenfatter den heterogene natur sykdom hos mennesker.

Abstract

Vestibular schwannomas (VSS) representerer Schwann celle (SC) svulster i vestibular nerve, at det går 10% av alle intrakranielle svulster. VSS oppstå i enten sporadisk eller familiære (Nevrofibromatose type 2, NF2) former, både knyttet til inaktive defekter i NF2 tumor suppressor gen. Behandling for VSS er generelt kirurgisk reseksjon eller radiosurgery, men sykelighet av slike prosedyrer har drevet undersøkelser i mindre invasive behandlinger. Historisk sett har manglende tilgang til ferske vevsprøver og det faktum at schwannoma cellene ikke blir foreviget vesentlig hemmet bruk av primærkulturer for etterforskning av schwannoma tumorigenesis. For å overvinne den begrensede tilførsel av primærkulturer, ble de udødelig HEI193 VS cellelinje generert ved transduksjon med HPV E6 og E7 onkogener. Det onkogene transduksjon innført betydelige molekylære og fenotypiske endringer i cellene, noe som begrenser deres anvendelse som en modell for human schwannoma svulster. Vi derfor illustrere en forenklet, reproduserbar protokoll for kultur av primær menneskelig VS celler. Dette lett mestret teknikken gjør det mulig for molekylære og cellulære undersøkelser som mer nøyaktig rekapitulere kompleksiteten i VS sykdom.

Introduction

Vestibular schwannomas (VSS) representerer Schwann celle (SC) svulster i vestibular nerve, at det går 10% av alle intrakranielle svulster ^1-3. VSS oppstå i enten sporadisk eller familiære (Nevrofibromatose type 2, NF2) former, både knyttet til inaktive defekter i NF2 tumor suppressor gen. Behandling for VSS er generelt kirurgisk reseksjon eller radiosurgery, men sykelighet av slike prosedyrer inkluderer døvhet, ansikts nevropatier, spinalvæske lekkasje, ubalanse, og svulst gjenvekst ^en. I tillegg er ikke alle pasienter er akseptable kirurgisk eller stråle kandidater. En slik betydelig sykelighet samt en mangel på alternative behandlingsformer har drevet etterforskning i den unike molekylærbiologi av VSS i håp om å utvikle nye behandlinger ^3,4.

Cellekultur gir mulighet for raske, lettvinte, og dyptgående analyse av molekylære og cellulære atferd og screening av potensielle terapeutiske compounds. Historisk sett har manglende tilgang til ferske vevsprøver og det faktum at schwannoma cellene ikke blir foreviget vesentlig hemmet bruk av primærkulturer for etterforskning av schwannoma tumorigenesis. For å overvinne den begrensede tilførsel av primærkulturer, ble de udødelig HEI193 VS cellelinje generert ved transduksjon med HPV E6 og E7 onkogener ^5. Det onkogene transduksjon innført betydelige molekylære og fenotypiske endringer i cellene, noe som begrenser deres anvendelse som en modell for human schwannoma tumorer. SC kulturer som stammer fra transgene mus linjer som mangler et funksjonelt NF2-genet representerer et annet alternativ for å undersøke NF2-avhengige SC tumorigenesis in vitro. Disse kulturene derimot ikke klarer å rekapitulere den heterogene natur menneskelig VSS eller konto for menneskelig bestemt atferd. De fleste tidligere VS kultur teknikker som kreves relativt lang saksbehandlingstid og kompliserte selektive kultur teknikker ^6-8.Her presenterer vi en enkel, reproduserbar protokoll for primær VS cellekultur med full prosessering på under tre timer, med 95% tumorcelle renhet som bestemmes av farging.

Protocol

Etikk Uttalelse: bruk av de menneskelige vevsprøver i denne protokollen ble godkjent av University of Iowa Institutional Review Board (IRB). En. Oppsett dagen før Tumor Harvests Coat Cell Kultur Plater: I en steril kultur hette, legger nok poly-L-ornithine (0,01% løsning) til å dekke bunnen av en isopor / plast kultur godt / parabol, erstatte lokkene, og la sitte i romtemperatur i minst 2 timer. Glass lysbilder eller dekkglass kan erstatte isopor for eksperimenter som krever b…

Representative Results

Riktig tumor fragmentering er viktig for optimal såing og utvekst i vevkulturskåler (figur 1). Identifisering av schwannoma celler i løpet av de første dagene etter plating er ofte vanskelig på grunn av obscuring mengder av celle-debris, og røde blodceller. Ved 4. eller 5. dag, vil celle utvidelser nærheten heft tumor fragmenter skape gjenkjennelige 'snøring' mønstre blant vrakrestene. Påfølgende medier endringer generelt fjerne mesteparten av ikke-adherente cell…

Discussion

Historie av in vitro schwannoma kulturer

Arbeidet med å etablere in vitro schwannoma kulturer begynte bare et par tiår etter den første Vestibularisschwannom åpen kirurgisk reseksjon skjedde i 1894 ^12. Den første registrerte kulturer var ved Kredel på 1920-tallet, som uten hell forsøkt å vokse hakket svulsten ved "hengende slipp-metoden" ¹² . Senere, Drs. Murray og Stout publisert sin in vitro kultur erfaring…

Materials

Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution	Sigma	P4957	Cell Culture Surface Treatment
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017-015 / L2020	Cell Culture Surface Treatment
0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-)	Sigma	C2674	Dissociation Reagent
0.25% Trypsin	Gibco	25200-056	Dissociation Reagent
TPS 100mm Round Culture Dish	Midwest Scientific	TP93100
Permanox 4 well slide	Fisher Scientific	1256521
Permanox 8 well slide	Fisher Scientific	1256522
Suction Filter Flask	Midwest Scientific	TP99500
15ml Conical Tube	Midwest Scientific	TP91015
50ml Conical Tube	Midwest Scientific	TP91050
2mL Round Bottom Tube	USA Scientific	1620-2700
Small Scissor	FST	14058-11
Small Forceps	FST	11251-20
Scalpel Handle	FST	10004-13
#11 Scalpel Blade	Roboz	RS-9801-11
Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish	Fisher Scientific	50-820-904
P1000 Pipetteman	Bioexpress	P3963-1000
Serological Pipetteman	Bioexpress	R3073-2P
Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips	Midwest Scientific	TD1250R
Insulated Ice Cooler
Culture Hood	Baker
Centrifuge	Eppendorf -5810R
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+)	Gibco	24020-117	Schwannoma Culture and Media Components
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+)	Gibco	14170-112	Schwannoma Culture and Media Components
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red	Gibco	11965-092	Schwannoma Culture and Media Components
N2 Supplement	Gibco	17502-048	Schwannoma Culture and Media Components
Fetal Bovine Serum	Gibco	26140-079	Schwannoma Culture and Media Components
Penicillin – Streptomycin	Gibco	15140-163	Schwannoma Culture and Media Components
Bovine Insulin (1mg/ml 200x)	Sigma	I6634	Schwannoma Culture and Media Components