Primär kultur av Human Vestibular Schwannomas
Summary
Vestibulär Schwannomas (VSS) är icke-maligna tumörer Schwann cell (SC) ursprung av, i samband med mutationer i NF2 tumörsuppressorgenen. Vi rapporterar en reproducerbar, effektivt protokoll för primär mänsklig VS cellkultur som möjliggör molekylära och cellulära experimentell manipulation och analys och rekapitulerar den heterogena karaktären av mänskliga sjukdomar.
Abstract
Vestibulära schwannomas (VSS) representerar Schwann cell (SC) tumörer i vestibulära nerven, kompromissa 10% av alla intrakraniella tumörer. VSS förekommer i antingen sporadiska eller familjära (Neurofibromatos typ 2, NF2) former, både i samband med inaktive defekter i NF2 tumorsuppressoren genen. Behandling för VSS är i allmänhet kirurgisk resektion eller strålkirurgi, men dödligheten i sådana förfaranden har drivit utredningar av mindre invasiva behandlingar. Historiskt sett har bristande tillgång till färska vävnadsprover och det faktum att schwannom celler inte förevigade avsevärt försvåras användningen av primärkulturer för utredning av schwannom tumörbildning. För att övervinna den begränsade tillgången på primära kulturer, var den immortaliserade HEI193 VS cellinje genereras genom transduktion med HPV E6-och E7-onkogener. Denna onkogen transduktion infört betydande molekylära och fenotypiska förändringar till cellerna, vilket begränsar deras användning som modell för mänskliga schwannoma tumörer. Vi illustrerar därför en förenklad, reproducerbar protokoll för odling av primära humana VS celler. Denna lätt behärskar tekniken möjliggör molekylära och cellulära utredningar som mer exakt rekapitulera komplexiteten i VS sjukdom.
Introduction
Vestibulära schwannomas (VSS) representerar Schwann cell (SC) tumörer i vestibulära nerven, kompromissa 10% av alla intrakraniella tumörer 1-3. VSS förekommer i antingen sporadiska eller familjära (Neurofibromatos typ 2, NF2) former, både i samband med inaktive defekter i NF2 tumorsuppressoren genen. Behandling för VSS är i allmänhet kirurgisk resektion eller strålkirurgi, men dödligheten i sådana förfaranden inkluderar dövhet, ansikts neuropatier, ryggmärgsvätskan läcka, obalans, och tumöråterväxt 1. Dessutom inte alla patienter är acceptabla kirurgiskt eller strålnings kandidater. En sådan hög sjuklighet samt en brist på alternativa terapier har drivit utredningen i det unika molekylärbiologi av VSS i hopp om att utveckla nya behandlingar 3,4.
Cellodlings möjliggör snabb, lättköpt, och djupgående analys av molekylära och cellulära beteende och screening av potentiella terapeutiska compounds. Historiskt sett har bristande tillgång till färska vävnadsprover och det faktum att schwannom celler inte förevigade avsevärt försvåras användningen av primärkulturer för utredning av schwannom tumörbildning. För att övervinna den begränsade tillgången på primära kulturer, var den immortaliserade HEI193 VS cellinje genereras genom transduktion med HPV E6-och E7-onkogener 5. Denna onkogen transduktion infört betydande molekylära och fenotypiska förändringar till cellerna, vilket begränsar deras användning som modell för mänskliga schwannom tumörer. SC kulturer som härrör från transgena mus linjer som saknar en funktionell NF2 gen representerar ett annat alternativ för att undersöka NF2-beroende SC tumorigenesis in vitro. Dessa kulturer misslyckas dock att rekapitulera den heterogena karaktären av mänskligt VSS eller konto för mänsklig specifikt beteende. De flesta tidigare VS odlingstekniker krävs relativt långa handläggningstider och komplicerade selektiva odlingstekniker 6-8.Här presenterar vi en enkel, reproducerbar protokoll för primär VS cellodling med fullständig bearbetning på under 3 timmar, med 95% av tumörceller renhet bestämd genom immunfärgning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Historia av in vitro schwannom kulturer
Arbetet med att etablera in vitro schwannom kulturer började bara några decennier efter den första akustiska neurom öppen kirurgisk resektion inträffade år 1894 12. De första inspelade kulturer var med Kredel på 1920-talet, som utan framgång försökt växa malet tumör med "hängande släpp-metoden" 12 . Senare, Dr. Murray och Stout publicerade sin in vitro-kultur upp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Support: NIDCD R01DC009801, P30DC010362, 5T32DC000040-17
Materials
| Poly-L-Ornithine, 0.01% Solution | Sigma | P4957 | Cell Culture Surface Treatment |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017-015 / L2020 | Cell Culture Surface Treatment |
| 0.2% Collagenase (dissolved in HBSS -/-) | Sigma | C2674 | Dissociation Reagent |
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | Dissociation Reagent |
| TPS 100mm Round Culture Dish | Midwest Scientific | TP93100 | |
| Permanox 4 well slide | Fisher Scientific | 1256521 | |
| Permanox 8 well slide | Fisher Scientific | 1256522 | |
| Suction Filter Flask | Midwest Scientific | TP99500 | |
| 15ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91015 | |
| 50ml Conical Tube | Midwest Scientific | TP91050 | |
| 2mL Round Bottom Tube | USA Scientific | 1620-2700 | |
| Small Scissor | FST | 14058-11 | |
| Small Forceps | FST | 11251-20 | |
| Scalpel Handle | FST | 10004-13 | |
| #11 Scalpel Blade | Roboz | RS-9801-11 | |
| Non-Tissue Culture 100mm Round Petri Dish | Fisher Scientific | 50-820-904 | |
| P1000 Pipetteman | Bioexpress | P3963-1000 | |
| Serological Pipetteman | Bioexpress | R3073-2P | |
| Sterile, Non-Filtered P1000 Pipette Tips | Midwest Scientific | TD1250R | |
| Insulated Ice Cooler | |||
| Culture Hood | Baker | ||
| Centrifuge | Eppendorf -5810R | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) +/+ (w/ Ca2+, Mg2+) | Gibco | 24020-117 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) -/- (w/out Ca2+, Mg2+) | Gibco | 14170-112 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose, w/ Phenol Red | Gibco | 11965-092 | Schwannoma Culture and Media Components |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-163 | Schwannoma Culture and Media Components |
| Bovine Insulin (1mg/ml 200x) | Sigma | I6634 | Schwannoma Culture and Media Components |
References
- Arthurs, B. J., et al. A review of treatment modalities for vestibular schwannoma. Neurosurg Rev. 34 (3), 265-277 (2011).
- Evans, G. R., Lloyd, S. K., Ramsden, R. T. Neurofibromatosis type 2. Adv Otorhinolaryngol. 70, 91-98 (2001).
- Fong, B., et al. The molecular biology and novel treatments of vestibular schwannomas. J Neurosurg. 115 (5), 906-914 (2011).
- Jacob, A., et al. Preclinical validation of AR42, a novel histone deacetylase inhibitor, as treatment for vestibular schwannomas. Laryngoscope. 122 (1), 174-189 (2012).
- Evans, D. G. Neurofibromatosis 2 [Bilateral acoustic neurofibromatosis, central neurofibromatosis. NF2, neurofibromatosis type II]. Genet Med. 11 (9), 599-610 (2009).
- Anniko, M., Noren, G. The Human Acoustic Neurinoma in Organ-Culture .1. Methodological Aspects. Acta Oto-Laryngologica. 91 (1-2), 47-53 (1981).
- Manent, J., et al. Magnetic cell sorting for enriching Schwann cells from adult mouse peripheral nerves. J Neurosci Methods. 123 (2), 167-173 (2003).
- Nair, S., et al. Primary cultures of human vestibular schwannoma: selective growth of schwannoma cells. Otol Neurotol. 28 (2), 258-263 (2007).
- Baur, A. M., et al. Laminin promotes differentiation, adhesion and proliferation of cell cultures derived from human acoustic nerve schwannoma. Acta Otolaryngol. 115 (4), 517-521 (1995).
- Cravioto, H., et al. Experimental neurinoma in tissue culture. Acta Neuropathol. 21 (2), 154-164 (1972).
- Kaasinen, S., et al. Culturing of acoustic neuroma–methodological aspects. Acta Otolaryngol Suppl. 520 Pt 1, 25-26 (1995).
- Kredel, F. E. Tissue Culture of Intracranial Tumors with a Note on the Meningiomas. Am J Pathol. 4 (4), 337-340 (1928).
- Murray, M. R., Stout, A. P., Bradley, C. F. Schwann cell versus fibroblast as the origin of the specific nerve sheath tumor: Observations upon normal nerve sheaths and neurilemomas in vitro. Am J Pathol. 16 (1), 41-60 (1940).
- Cravioto, H., Lockwood, R. The behavior of acoustic neuroma in tissue culture. Acta Neuropathol. 12 (2), 141-157 (1969).
- Lee, J. D., et al. Genetic and epigenetic alterations of the NF2 gene in sporadic vestibular schwannomas. PLoS One. 7 (1), 30418 (2012).
- Wippold, F. J., 2nd, , et al. Neuropathology for the neuroradiologist: Antoni A and Antoni B tissue patterns. AJNR Am J Neuroradiol. 28 (9), 1633-1638 (2007).
- Mennel, H. D. Short-term tissue culture observations of experimental primary and transplanted nervous system tumors. J Neuropathol Exp Neurol. 39 (6), 639-660 (1980).
- Rosenbaum, C., et al. Isolation and characterization of Schwann cells from neurofibromatosis type 2 patients. Neurobiol Dis. 5 (1), 55-64 (1998).
