These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.
में स्टेंट restenosis व्यापक रूप से कोरोनरी और परिधीय धमनियों के गंभीर रूप से संकुचित खंडों के माध्यम से फिर से स्थापित रक्त के प्रवाह के लिए इस्तेमाल किया स्टेंट आधारित revascularization प्रक्रियाओं की एक प्रमुख जटिलता प्रस्तुत करता है. एक वैकल्पिक रणनीति उपस्थित हो सकता है विरोधी restenotic गतिविधि के साथ जीन की ट्यून करने योग्य रिलीज करने में सक्षम Endovascular स्टंट्स वर्तमान में दवा eluting स्टेंट का इस्तेमाल किया है. आम तौर पर वेक्टर की भौतिक फंसाने के लिए इस्तेमाल किया बहुलक कोटिंग्स के साथ जुड़े एक अत्यधिक भड़काऊ प्रतिक्रिया से परहेज करते हुए नैदानिक अनुवाद प्राप्त करने के लिए, जीन एल्यूटिंग स्टंट्स, स्टेंट-स्थिर जीन वेक्टर रिहाई और vasculature की साइट विशेष पारगमन की उम्मीद के मुताबिक कैनेटीक्स प्रदर्शन करना चाहिए. इस पत्र बिसफ़ॉस्फ़ोनेट (PABT) hydrolysable पार Linkers (एचसी) के माध्यम से स्टेनलेस स्टील की सतह -modified polyallylamine को adenoviral कणों की एक प्रतिवर्ती बंधन पर आधारित स्टंट्स को adenoviral जीन वैक्टर coatless tethering के लिए एक विस्तृत कार्यप्रणाली का वर्णन है. का एक परिवारबीच 5 और 50 दिनों लेकर में श्रृंखला एस्टर hydrolysis के एक औसत टी 1/2 साथ bifunctional (amine- और thiol प्रतिक्रियाशील) कोर्ट स्टेंट के साथ वेक्टर लिंक करने के लिए इस्तेमाल किया गया. वेक्टर स्थिरीकरण प्रक्रिया आम तौर पर 9 घंटे के भीतर बाहर ले गए और कई चरण होते है: PABT (4 घंटा) की एक जलीय घोल में धातु नमूनों की 1) ऊष्मायन; Tris (2 carboxyethyl) phosphine (20 मिनट) के साथ PABT में स्थापित thiol समूहों के 2) deprotection; Pyridyldithio (पीडीटी) समूह (2 घंटा) के साथ derivatized polyethyleneimine साथ नमूने प्रतिक्रिया द्वारा धातु की सतह के thiol प्रतिक्रियाशील क्षमता के 3) विस्तार; Dithiothreitol (10 मिनट) के साथ thiols को पीडीटी समूहों में से 4) रूपांतरण; कोर्ट (1 घंटा) के साथ एडिनोवायरस की 5) संशोधन; आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी स्तंभ (15 मिनट) और thiolated स्टील सतह (1 घंटा) पर thiol प्रतिक्रियाशील adenoviral कणों की 7) स्थिरीकरण द्वारा संशोधित adenoviral कणों की 6) शुद्धि. इस तकनीक, स्टंट्स से परे व्यापक संभावित प्रयोज्यता हैप्रत्यारोपित विदेशी सामग्री interfacing कोशिकाओं को सब्सट्रेट की मध्यस्थता जीन डिलीवरी के माध्यम से उनके biocompatibility बढ़ाने के लिए bioprosthetic उपकरणों की सतह इंजीनियरिंग की सुविधा से.
एक चिकित्सीय साधन के रूप में जीन थेरेपी की प्रभावशीलता जीन थेरेपी वैक्टर 1,2 के गरीब लक्ष्यीकरण क्षमता आड़े आती है. लक्ष्य स्थान पर transgene अभिव्यक्ति की उप चिकित्सीय स्तर में उचित लक्ष्यीकरण परिणामों की कमी और, वेक्टर और इनकोडिंग चिकित्सीय उत्पाद 4 दोनों के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ते के लिए जिम्मेदार लोगों सहित गैर लक्ष्य अंगों 3, करने के लिए वैक्टर का एक व्यापक प्रसार की ओर जाता है 5. एक संभावित पारगमन की संकीर्णता ऑफसेट करने और लक्ष्यीकरण रक्त और लसीका के माध्यम से उनके मुक्त प्रसार precludes कि एक प्रपत्र में इच्छित स्थान पर जीन वैक्टर लागू है को बढ़ावा देने के लिए इसका मतलब है. आमतौर पर, इस तरह के प्रयासों को शारीरिक रूप से वें entrapping द्वारा इंजेक्शन स्थल पर क्षणिक बनाए रखने जीन वैक्टर करने में सक्षम हैं कि आतंच, मज्जा या एसिड हाइड्रोजेल matrices 6-10 साथ admixed वायरल या गैर वायरल वैक्टर या तो की, जिसमें एक स्थानीय रूप से इंजेक्शन वितरण प्रणाली पर भरोसाएक polymeric नेटवर्क में उन्हें.
स्थानीयकृत जीन थेरेपी के लिए एक और आम तौर पर स्वीकार प्रतिमान प्रत्यारोपित कृत्रिम उपकरणों 11,12 की सतह पर जीन वैक्टर के स्थिरीकरण का इस्तेमाल करता. स्थायी चिकित्सा प्रत्यारोपण (ENDOVASCULAR, ब्रोन्कियल, मूत्र संबंधी और जठरांत्र स्टंट्स, पेसमेकर, कृत्रिम जोड़ों, शल्य चिकित्सा और स्त्रीरोगों meshes, आदि.) रोगियों 13 के करोड़ों में वार्षिक उपयोग किया जाता है. आम तौर पर प्रभावी जबकि, इन उपकरणों अपर्याप्त मौजूदा चिकित्सा पद्धतियों 14-17 से लिए नियंत्रित कर रहे हैं कि जटिलताओं से ग्रस्त हैं. Implantable कृत्रिम उपकरणों स्थानीयकृत जीन थेरेपी उपचार के लिए प्रॉक्सी प्लेटफॉर्म के रूप में सेवा करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रस्तुत करते हैं. फार्माकोकाइनेटिक दृष्टि, उनके व्यापार के कैनेटीक्स प्रत्यारोपण / ऊतक इंटरफेस पर जीन वैक्टर उच्च स्थानीय सांद्रता दोनों को प्राप्त करने और धीमा करने में जीन वैक्टर परिणामों की अपेक्षाकृत कम निवेश खुराक के साथ चिकित्सा प्रत्यारोपण की सतह derivatization सेइस स्थान से आर उन्मूलन. लक्षित सेल की आबादी से एक दीर्घ निवास के परिणाम और बढ़ाया तेज के रूप में, वेक्टर स्थिरीकरण जीन वेक्टर का प्रसार कम करता है. इस प्रकार गैर लक्ष्य ऊतकों के अनजाने टीका कम है.
(भी सब्सट्रेट की मध्यस्थता जीन डिलीवरी या ठोस चरण जीन डिलीवरी के रूप में कहा) प्रत्यारोपण biomaterials पर जीन वैक्टर भूतल tethering का उपयोग सेल संस्कृति और पशु प्रयोगों में लागू किया गया है दोनों विशिष्ट (प्रतिजन प्रतिरक्षी 18-20, avidin बायोटिन 21,22) और 23-26 (प्रभारी, वान डर वाल्स) बातचीत गैर विशिष्ट. सतह के साथ जरूरत से ज्यादा मजबूत बांड लक्ष्य कोशिकाओं द्वारा वेक्टर internalization रोकता के बाद से प्रत्यारोपित डिवाइस की सतह को वैक्टर के सहसंयोजक लगाव पहले गैर कार्यात्मक रूप में माना गया है. हाल ही में यह इस सीमा TET के रूप में इस्तेमाल अनायास hydrolysable पार linker के उपयोग के माध्यम से दूर किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया गयाadenoviral वेक्टर 27,28 के स्टेंट और कैप्सिड प्रोटीन की संशोधित धातु की सतह के बीच उसका. इसके अलावा, वेक्टर रिहाई की दर और इन विट्रो में और vivo में transgene अभिव्यक्ति के समय पाठ्यक्रम हाइड्रोलिसिस 28 के विभिन्न कैनेटीक्स प्रदर्शन hydrolysable पार Linkers के उपयोग के साथ संग्राहक जा सकता है.
वर्तमान कागज सक्रिय धातु की सतह को adenoviral वैक्टर प्रतिवर्ती सहसंयोजक लगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है और स्टेंट एंजियोप्लास्टी की चूहा मन्या मॉडल में सुसंस्कृत चिकनी मांसपेशियों और endothelial कोशिकाओं में और vivo में इन विट्रो में आगामी पारगमन की घटनाओं के अध्ययन के लिए एक उपयोगी प्रयोगात्मक स्थापना का परिचय .
प्रस्तुत प्रोटोकॉल स्टेनलेस स्टील सतहों coatless को adenoviral वैक्टर प्रतिवर्ती लगाव के माध्यम से हासिल की सब्सट्रेट मध्यस्थता जीन डिलीवरी के लिए एक संचालन विधि का वर्णन है. नाड़ी restenosis की स्टेंट आधारित जीन थे…
The authors have nothing to disclose.
The authors do not have competing financial interests to disclose.
316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP ) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
Cephazolin | Apotex | not available | |
Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
Fine scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
Insyte Autoguard 24G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
PTA catheter | NuMed | custom order | |
Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
Saline | Baxter | 281321 | |
10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |