Vasculaire Transfert de gènes à partir de stent métallique surfaces à l'aide vecteurs adénoviraux Tethered par hydrolysables de la Croix-linkers
Summary
These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.
Abstract
Resténose intra-stent présente une complication majeure des procédures de revascularisation base d'endoprothèse largement utilisés pour rétablir le flux sanguin dans les segments rétrécies de manière critique des artères coronaires et périphériques. Stents endovasculaires capables de libérer accordable de gènes ayant une activité anti-resténose peut présenter une stratégie alternative à l'heure actuelle utilisés stents à élution médicamenteuse. Afin de réaliser l'application clinique, les stents de gènes élution doivent présenter une cinétique prévisibles de gène libération de vecteur de stent immobilisé et la transduction spécifique de site de la vascularisation, tout en évitant une réponse inflammatoire excessive typiquement associé aux revêtements polymères utilisés pour le piégeage physique du vecteur. Cet article décrit une méthodologie détaillée pour tethering sans manteau de vecteurs de gènes adénoviraux de stents basé sur une liaison réversible des particules adénoviraux à polyallylamines bisphosphonate (PABT) -Modified surface en acier inoxydable par des agents de réticulation hydrolysables (HC). Une famille deHC bifonctionnel (amine et thiol-réactif) avec un t 1/2 moyenne de l'hydrolyse de l'ester dans la chaîne comprise entre 5 et 50 jours ont été utilisés pour lier le vecteur avec le stent. La procédure d'immobilisation vecteur est typiquement réalisée à l'intérieur de 9 h et se compose de plusieurs étapes: 1) l'incubation des échantillons de métal dans une solution aqueuse de PABT (4 h); 2) la déprotection des groupes thiol installés dans PABT avec le tris (2-carboxyéthyl) phosphine (20 min); 3) augmentation de la capacité réactif thiol de la surface métallique en faisant réagir les échantillons avec de la polyéthylèneimine pyridyldithio dérivés avec des groupes (PDT) (2 heures); 4) la conversion des groupes thiols de PDT avec du dithiothréitol (10 min); 5) la modification des adénovirus avec HC (1 h); 6) la purification de particules d'adénovirus modifiés par chromatographie d'exclusion stérique colonne (15 min) et 7) l'immobilisation des particules adénovirales thiol réactif sur la surface de l'acier thiolé (1 h). Cette technique a une large applicabilité potentielle au-delà des stents,en facilitant l'ingénierie de surface des dispositifs bioprothèses pour améliorer leur biocompatibilité grâce à la prestation de gène substrat médiée par les cellules d'interfaçage matériel étranger implanté.
Introduction
L'efficacité de la thérapie génique en tant que modalité thérapeutique est entravée par la capacité de ciblage de mauvais vecteurs de thérapie génique 1,2. L'absence de résultats de ciblage appropriés dans les niveaux sous-thérapeutiques de l'expression du transgène à l'emplacement cible et conduit à une large diffusion des vecteurs aux organes non ciblés 3, y compris ceux qui sont responsables pour le montage des réponses immunitaires à la fois contre le vecteur et produit thérapeutique codé 4, 5. Un potentiel signifie pour compenser la promiscuité de transduction et de promouvoir le ciblage est d'introduire des vecteurs de gènes à l'endroit désiré dans une forme qui empêche leur diffusion gratuite par le sang et la lymphe. Typiquement, de tels efforts sont tributaires de systèmes d'administration locale injectables comprenant soit des vecteurs viraux ou non viraux mêlé de fibrine, collagène ou un hydrogel d'acide hyaluronique matrices 10.6 qui sont capables de soutenir de manière transitoire des vecteurs de gène au niveau du site d'injection en piégeant physiquement èmeem dans un réseau polymère.
Un autre modèle généralement accepté pour la thérapie génique localisée immobilisation utilise des vecteurs de gènes à la surface des prothèses implantées 11,12. Implants médicaux permanents (endovasculaires, bronchiques, urologiques et gastro-intestinaux stents, stimulateurs cardiaques, articulations artificielles, des filets chirurgicaux et gynécologiques, etc.) Sont utilisés chaque année des dizaines de millions de patients 13. Bien que généralement efficaces, ces dispositifs sont sujettes à des complications qui sont insuffisamment contrôlés par les pratiques médicales actuelles 14-17. Prothèses implantables présentent une occasion unique de servir de plates-formes de substitution pour le traitement localisé de la thérapie génique. Du point de vue pharmacocinétique, la dérivatisation de la surface d'implants médicaux avec des doses relativement faibles d'entrée de vecteurs de gènes conduit à la réalisation de deux des concentrations locales élevées de vecteurs de gènes de l'interface implant / tissu et le ralentissement de la cinétique de their élimination de ce lieu. En conséquence de séjour prolongée et améliorée par l'absorption de la population cellulaire ciblée, l'immobilisation vecteur minimise la propagation du vecteur de gène. Ainsi, l'inoculation par inadvertance des tissus non cibles est réduite.
attache de surface des vecteurs de gènes sur les biomatériaux implantables (appelées également que la livraison de gène substrat médiation ou la livraison de gènes en phase solide) a été mis en œuvre dans la culture de cellules animales et des expériences utilisant à la fois spécifique (antigène-anticorps 18-20, avidine-biotine 21,22) et non spécifique 23-26 (charge, de van der Waals) interactions. La fixation covalente de vecteurs à la surface du dispositif implanté a été précédemment considéré comme non fonctionnel car excessivement fortes liaisons avec la surface empêchent vecteur internalisation par les cellules cibles. Récemment, il a été démontré que cette limitation peut être surmontée par l'utilisation d'hydrolysable spontanément agent de réticulation utilisé comme tetsienne entre la surface métallique mise à jour de l'endoprothèse et les protéines de capside du vecteur adénoviral 27,28. En outre, la vitesse de libération de vecteur et évolution dans le temps de l'expression du transgène in vitro et in vivo peuvent être modulées à l'aide d'agents de reticulation hydrolysables présentant des cinétiques d'hydrolyse 28.
Le présent document présente un protocole détaillé pour la fixation covalente réversible des vecteurs adénoviraux à la surface de métal actif et présente un dispositif expérimental utile pour l'étude qui ont suivi les événements de transduction in vitro dans le muscle lisse de culture et les cellules endotheliales et in vivo dans le modèle de la carotide de rat de stent d'angioplastie .
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole présenté décrit un mode opératoire pour la délivrance de gènes à médiation de substrat obtenue par l'attachement réversible de vecteurs adénoviraux pour des surfaces sans manteau en acier inoxydable. Bien que développé dans le but spécifique de traitement de la resténose vasculaire gène à base d'endoprothèse, cette technique a des applications beaucoup plus larges dans les domaines des biomatériaux, des implants biomédicaux et la thérapie génique.
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have competing financial interests to disclose.
Materials
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP ) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
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