Transferencia génica vascular de Stent metálico superficies utilizando Adenoviral Vectores anclada a través hidrolizables reticulantes
Summary
These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.
Abstract
En reestenosis intra-stent presenta una importante complicación de procedimientos de revascularización base del stent ampliamente utilizados para restablecer el flujo sanguíneo a través de los segmentos estrechados críticamente de las arterias coronarias y periféricas. Stents endovasculares capaces de liberación sintonizable de genes con actividad anti-reestenosis puede presentar una estrategia alternativa para utilizan actualmente los stents liberadores de fármacos. A fin de alcanzar traducción clínica, los stents de elución de genes deben presentar una cinética predecible de liberación de genes vector stent-inmovilizada y la transducción específica de sitio de la vasculatura, evitando al mismo tiempo una respuesta inflamatoria excesiva típicamente asociados con los recubrimientos de polímeros utilizados para atrapamiento físico del vector. Este artículo describe una metodología detallada para la inmovilización sin abrigo de vectores de genes adenovirales a los stents basados en una unión reversible de las partículas adenovirales a polialilamina bifosfonato (PABT) modificada con superficie de acero inoxidable a través de reticulantes hidrolizables (HC). Una familia debifuncional HC (con amina y reactivo con tiol) con una media t medio de la hidrólisis del éster en la cadena que oscila entre los 5 y 50 días se utiliza para vincular el vector con el stent. El procedimiento vector inmovilización se lleva a cabo típicamente en 9 horas y consta de varios pasos: 1) la incubación de las muestras de metal en una solución acuosa de PABT (4 horas); 2) desprotección de grupos tiol instalados en PABT con tris (2-carboxietil) fosfina (20 min); 3) la expansión de la capacidad de reactivo con tiol de la superficie metálica por reacción de las muestras con polietilenimina derivatizados con grupos (PDT) piridilditio (2 hr); 4) la conversión de los grupos PDT a tioles con ditiotreitol (10 min); 5) la modificación de los adenovirus con HC (1 hr); 6) la purificación de partículas adenovirales modificados por cromatografía de exclusión por tamaño en columna (15 min) y 7) la inmovilización de partículas adenovirales reactivos con tiol sobre la superficie de acero tiolada (1 hr). Esta técnica tiene una aplicabilidad potencial amplia más allá de stents,facilitando la ingeniería de superficie de dispositivos bioprotésicas para mejorar su biocompatibilidad a través de la entrega de genes mediada por sustrato a las células de interfaz el material extraño implantado.
Introduction
La eficacia de la terapia génica como una modalidad terapéutica se ve obstaculizada por la escasa capacidad de focalización de los vectores de terapia génica 1,2. La falta de resultados de focalización adecuados en los niveles sub-terapéuticos de la expresión del transgen en la ubicación de destino y conduce a una amplia difusión de los vectores a los órganos ajenos al objetivo 3, incluidos los responsables de montar la respuesta inmune contra tanto el vector como producto terapéutico codificado 4, 5. Un medio potencial para compensar la promiscuidad de transducción y para promover la focalización es introducir vectores de genes en el lugar deseado en una forma que impide su libre difusión a través de la sangre y la linfa. Típicamente, dichos esfuerzos se basan en sistemas de administración local inyectable que comprende ya sea de vectores virales o no virales mezcladas con fibrina, colágeno o ácido hialurónico matrices de hidrogel 6-10 que son capaces de vectores de genes transitoriamente sostienen en el sitio de inyección atrapando físicamente ªem en una red polimérica.
Otro paradigma generalmente aceptado para la terapia génica localizada utiliza inmovilización de vectores génicos en la superficie de los dispositivos prostéticos implantados 11,12. Implantes médicos permanentes (endovasculares, bronquiales, stents urológicos y digestivos, marcapasos, articulaciones artificiales, mallas quirúrgicas y ginecológicas, etc.) Se utilizan cada año en decenas de millones de pacientes 13. Aunque, en general eficaz, estos dispositivos son propensos a complicaciones que no están adecuadamente controlados por las prácticas médicas actuales 14-17. Prótesis implantables presentan una oportunidad única para servir como plataformas de proxy para el tratamiento de la terapia génica localizada. Desde el punto de vista farmacocinético, la derivación de superficie de implantes médicos con dosis relativamente bajas de entrada de vectores de genes resultados en la consecución de los dos altas concentraciones locales de vectores de genes en la interfaz implante / tejido y la desaceleración de la cinética de their eliminación de esta ubicación. Como consecuencia de la residencia prolongada y una mayor captación por la población de células objetivo, vector inmovilización minimiza la propagación del vector de genes. De este modo se reduce la inoculación accidental de los tejidos no diana.
Tethering Superficie de vectores de genes en biomateriales implantables (también denominado como la entrega de genes sustrato o mediada por la entrega de genes en fase sólida) se ha implementado en cultivo de células animales y experimentos utilizando tanto específica (antígeno-anticuerpo 18-20, avidina-biotina 21,22) y no específicos 23-26 (con cargo, de van der Waals) interacciones. La unión covalente de vectores a la superficie del dispositivo implantado se ha considerado previamente como no funcional, ya excesivamente fuertes lazos con la superficie impiden vector de internalización por las células diana. Recientemente se demostró que esta limitación se puede superar mediante el uso de espontáneamente hidrolizable reticulante utilizado como el tetde ella entre la superficie metálica modificada de las proteínas de la cápside de stent y el vector adenoviral 27,28. Por otra parte, la velocidad de liberación del vector y curso temporal de la expresión del transgen in vitro e in vivo pueden ser moduladas con el uso de hidrolizables reticulantes que exhiben diferentes cinéticas de hidrólisis 28.
El presente documento proporciona un protocolo detallado para la unión covalente reversible de vectores adenovirales a la superficie de metal activo y presenta una configuración experimental útil para el estudio subsiguientes eventos de transducción in vitro en el músculo liso cultivadas y las células endoteliales e in vivo en el modelo de carótida de rata de angioplastia stent .
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado describe un método operativo para la entrega de genes mediada sustrato logrado a través de unión reversible de vectores adenovirales sin abrigo para superficies de acero inoxidable. Si bien desarrollado para el propósito específico de la terapia génica basada en stent de la reestenosis vascular, esta técnica tiene aplicaciones mucho más amplias en las áreas de biomateriales, implantes biomédicos y la terapia génica.
Aunque los estudios presentados ún…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have competing financial interests to disclose.
Materials
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP ) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
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