Сосудистая перенос генов из металлического стента поверхностей Использование аденовирусные векторы ПРИВЯЗНЫХ через ГИДРОЛИЗНОГО сшивателей
Summary
These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.
Abstract
В рестеноз внутри стента представляет собой серьезную усложнение процедур реваскуляризации стентов на основе широко используемых для восстановления кровотока через критически прищурив сегментах коронарных и периферических артерий. Эндоваскулярные стенты, способные перестраиваемой выпуска генов с анти-restenotic деятельности может представить альтернативную стратегию, чтобы в настоящее время используется стентов с лекарственным покрытием. Для достижения клинического перевод, ген-стенты должны обладать предсказуемые кинетику стента с иммобилизованным гена вектора выпуска и сайт-специфической трансдукции сосудистой, избегая при этом чрезмерного воспалительную реакцию, как правило, связанный с полимерных покрытий, используемых для физического захвата вектора. Эта статья описывает подробная методология без пальто привязывать аденовирусных векторов генов к стентов на основе обратимое связывание аденовирусных частиц полиаллиламин бифосфонат (PABT) -modified поверхность из нержавеющей стали с помощью гидролизуемыми сшивателей (HC). Семействобифункциональное (аминов и тиол-реактивный) ХК со средней т 1/2 части эфира гидролиза в-цепи в пределах от 5 до 50 дней были использованы, чтобы связать вектор с стента. Процедура иммобилизации вектор, как правило, осуществляется в течение 9 ч и состоит из нескольких этапов: 1) инкубации образцов металлов в водном растворе PABT (4 ч); 2) удаление защитной группы тиоловых групп, установленных в PABT с трис (2-карбоксиэтил) фосфина (20 мин); 3) расширение тиол реактивной мощности на поверхности металла с помощью реакции образцов с полиэтиленимина дериватизированных с группами пиридилдитио (PDT) (2 ч); 4) превращение ФДТ групп тиолов с дитиотреитола (10 мин); 5) изменение аденовирусов с HC (1 час); 6) очистка аденовирусных частиц, модифицированных с помощью гель-хроматографии на колонке (15 мин) и 7) иммобилизации тиоловых-реактивного аденовирусных частиц на поверхности стали тиолированного (1 ч). Этот метод имеет широкий потенциал применения вне стентов,путем содействия поверхности инжиниринг биопротезом устройств для повышения их биосовместимость через подложки-опосредованной доставки генов к клеткам, взаимодействующими имплантированный посторонние материалы.
Introduction
Эффективность генной терапии в качестве лечебного воздействия затрудняется плохой способности адресности генной терапии векторов 1,2. Отсутствие надлежащих результатов адресности в суб-терапевтических уровней экспрессии трансгена на целевые места и приводит к широкому распространению векторов в нецелевых органов 3, в том числе лиц, ответственных за монтаж иммунный ответ против как вектора и кодируемого терапевтического продукта 4, 5. Одним из потенциальных означает, чтобы компенсировать распущенность трансдукции и содействовать таргетинг является введение генных векторов в нужном месте в форме, исключающей их свободное распространение через кровь и лимфу. Как правило, такие попытки опираться на локально инъекций систем доставки, содержащих либо из вирусных или невирусных векторов в смеси с фибрина, коллагена или гиалуроновой кислоты гидрогелевых матриц 6-10, которые способны временно, выдерживающих генных векторов в месте инъекции, физически улавливания-еEM в полимерной сети.
Другой общепринятой парадигмой локализованной генной терапии использует иммобилизация генных векторов на поверхности имплантированных протезов 11,12. Постоянные медицинские имплантаты (эндоваскулярные, бронхов, урологические и желудочно-кишечные стенты, кардиостимуляторы, искусственные суставы, хирургические и гинекологические сеток и т.д..) Будут ежегодно использоваться в десятки миллионов пациентов 13. В то время как в целом эффективны, эти устройства склонны к осложнениям, которые неадекватно контролируемых для текущими медицинской практике 14-17. Имплантируемые протезы представляют собой уникальную возможность служить прокси платформ для местной обработки генной терапии. С фармакокинетической точки зрения, дериватизации поверхности медицинских имплантатов с относительно низкими дозами входных векторов гена приводит к достижению как высокие локальные концентрации генных векторов на имплантат / интерфейса ткани и замедление кинетики Theiустранение г из этой папки. Как следствие длительное проживание и повышенной поглощением целевой популяции клеток, вектор иммобилизации сводит к минимуму распространение вектора гена. Таким образом, случайное прививка нецелевых тканях уменьшается.
Поверхность привязывать генных векторов на имплантируемых биоматериалов (также называют как субстрат-опосредованной доставки генов или твердой фазе доставки генов) была реализована в культуре и животных клеток экспериментов с использованием как конкретных (антиген-антитело 18-20, авидин-биотин 21,22) и неспецифическая 23-26 (платно, ван-дер-Ваальса) взаимодействий. Ковалентное присоединение векторов к поверхности имплантированного устройства ранее рассматривать как нефункциональные, так как слишком сильные связи с поверхностью исключает вектор интернализации клетками-мишенями. Недавно было показано, что это ограничение может быть преодолено за счет использования самопроизвольно гидролизуемого сшивающего агента, используемого в качестве Tetу нее между модифицированной металлической поверхности стента и капсида белков аденовирусного вектора 27,28. Кроме того, скорость высвобождения вектора и временной ход экспрессии трансгена в пробирке и в естественных условиях можно модулировать с использованием гидролизуемых сшивающих агентов, обладающих различными кинетики гидролиза 28.
В настоящем документе содержится подробный протокол для обратимого ковалентного аденовирусных векторов в активированной поверхности металла и представляет полезную экспериментальная установка для изучения вытекающие трансдукции события в пробирке в культуре гладкомышечных и эндотелиальных клеток и в естественных условиях в крыса сонной модели стента ангиопластики .
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный протокол описывает оперативный метод подложки опосредованной доставки генов достигается за счет обратимого присоединения аденовирусных векторов для пиджака поверхностей из нержавеющей стали. В то время как разработаны для конкретной цели стента на основе генной …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have competing financial interests to disclose.
Materials
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP ) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
- Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
- Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
- Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
- Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
- De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
- Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
- Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
- Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
- Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
- Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
- Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
- Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. . Advance Data. 191, (1991).
- Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
- Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
- Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
- Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
- Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
- Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
- Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
- Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
- Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
- Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
- Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
- Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
- Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
- Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
- Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
- Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
- Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
- Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
- Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56 (2010).
- Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
- Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).
