These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.
Reestenose intra-stent apresenta uma das principais complicações de procedimentos de revascularização à base de stents utilizados para restabelecer o fluxo de sangue através de segmentos criticamente estreitados de artérias coronárias e periféricas. Stents endovasculares capazes de liberação ajustável de genes com atividade anti-reestenose pode apresentar uma estratégia alternativa para actualmente utilizado stents farmacológicos. A fim de atingir tradução clínico que os stents de genes deve apresentar uma cinética previsível de libertação do gene vector imobilizada-stent e transdução específica do local da vasculatura, evitando ao mesmo tempo uma resposta inflamatória excessiva normalmente associado com os revestimentos de polímero utilizados para a retenção física do vector. Este artigo descreve uma metodologia detalhada para tethering sem casaco de vetores de genes de adenovírus para stents com base em uma ligação reversível das partículas de adenovírus para polialilamina bifosfonato (PABT) -Modified superfície de aço inoxidável via reticulantes hidrolisáveis (HC). Uma família debifuncional HC (aminas e tiol-reactivo) com uma média de t 1/2 de hidrólise do éster em cadeia que varia entre 5 e 50 dias foram utilizados para ligar o vector com o stent. O procedimento de imobilização vector é tipicamente levada a cabo a cerca de 9 horas e consiste em várias etapas: 1) a incubação das amostras de metal numa solução aquosa de PABT (4 horas); 2) desprotecção de grupos tiol instalados em PABT com tris (2-carboxietil) fosfina (20 min); 3) aumento da capacidade de tiol reactivo da superfície do metal por reacção das amostras com polietilenoimina derivatizados com grupos piridilditio) (PDT (2 h); 4) a conversão dos grupos tióis a PDT com ditiotreitol (10 min); 5) alteração de adenovírus com HC (1 hora); 6) purificação de partículas de adenovírus modificados por meio de cromatografia de exclusão de tamanho da coluna (15 min) e 7) a imobilização de partículas adenovirais tiol-reactivo na superfície de aço tiolada (1 hr). Esta técnica tem uma ampla aplicabilidade potencial além stentsfacilitando a engenharia de superfícies de dispositivos bioprostéticas para melhorar sua biocompatibilidade com a entrega de genes mediada por substrato para as células de interface do material estranho implantado.
A eficácia da terapia do gene como uma modalidade terapêutica é dificultada pela capacidade de direccionamento pobre de vectores de terapia génica 1,2. A falta de segmentação resultados adequados nos níveis sub-terapêuticos de expressão do transgene no local de destino e leva a uma ampla disseminação de vetores de órgãos não-alvo 3, incluindo os responsáveis pela montagem respostas imunes contra tanto o vetor e codificado produto terapêutico 4, 5. Um potencial significa para compensar a promiscuidade de transdução e promover a segmentação é introduzir vetores de genes no local desejado de uma forma que impede a sua disseminação através do sangue e da linfa. Tipicamente, esses esforços contar com um sistema de entrega localmente injectáveis compreendendo quer de vectores virais ou não virais misturados com fibrina, colagénio ou matrizes de hidrogel de ácido hialurónico 6-10, que são capazes de sustentar transitoriamente vectores de genes no local de injecção por aprisionamento físico thin em uma rede polimérica.
Outro paradigma geralmente aceite para terapia génica localizada utiliza imobilização de vectores de genes para a superfície de próteses implantadas 11,12. Implantes médicos permanentes (endovasculares, brônquios, os stents urológicas e gastrointestinais, pacemakers, juntas artificiais, malhas cirúrgicas e ginecológicas, etc.) São utilizados anualmente em dezenas de milhões de pacientes 13. Embora geralmente eficaz, estes dispositivos são propensas a complicações que são inadequadamente controlados pelo práticas médicas atuais 14-17. Próteses implantáveis apresentam uma oportunidade única para servir de plataforma de proxy para tratamento de terapia genética localizada. Do ponto de vista farmacocinético, derivatização da superfície dos implantes médicos com doses relativamente baixas de entrada dos vectores de genes resulta na obtenção de ambas as concentrações locais elevadas de vectores de genes para a interface do implante / tecido e reduzindo a cinética de their eliminação desta localidade. Como conseqüência de residência prolongada e aumento da captação pela população de células alvo, vetor imobilização minimiza propagação do vetor gene. Assim, a inoculação acidental de tecidos não-alvo é reduzida.
Superfície tethering de vetores de genes em biomateriais implantáveis (também denominado como a entrega do gene mediada por substrato ou entrega gene fase sólida) foi implementado em cultura de células animais e experimentos utilizando ambos específica (antígeno-anticorpo 18-20, avidina-biotina 21,22) e não-específico (23-26 carga, van der Waals) interações. A ligação covalente de vectores para a superfície do dispositivo implantado tem sido anteriormente considerado como não funcional uma vez que demasiado fortes ligações com a superfície exclui vector internalização pelas células alvo. Recentemente foi demonstrado que esta limitação pode ser superada através da utilização de espontaneamente hidrolisável reticulante utilizado como o tetdela entre a superfície metálica modificada das proteínas da cápside de stent e o vector adenoviral de 27,28. Além disso, a taxa de libertação do vetor e naturalmente o tempo de expressão do transgene in vitro e in vivo, pode ser modulada, com o uso de agentes de ligação cruzada hidrolizáveis que exibem diferentes cinéticas de hidrólise 28.
O presente documento fornece um protocolo detalhado para a ligação covalente reversível de vectores adenovirais para a superfície do metal activado e apresenta uma configuração experimental útil para estudar os eventos subsequentes de transdução in vitro de músculo liso e células endoteliais em cultura e in vivo no modelo da carótida de rato de angioplastia de stent .
O protocolo apresentado descreve um método operacional para a entrega de genes mediada substrato conseguida através de fixação reversível de vectores adenovirais sem casaco para as superfícies de aço inoxidável. Embora desenvolvido para a finalidade específica de terapia genética baseada em stent de reestenose vascular, esta técnica tem aplicações muito mais amplas nas áreas de biomateriais, implantes biomédicos e terapia gênica.
Embora os estudos apresentados têm apen…
The authors have nothing to disclose.
The authors do not have competing financial interests to disclose.
316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP ) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
Cephazolin | Apotex | not available | |
Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
Fine scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
Insyte Autoguard 24G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
PTA catheter | NuMed | custom order | |
Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
Saline | Baxter | 281321 | |
10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |