加水分解性架橋剤を介してアデノウイルスベクターテザーを使用した金属ステント表面からの血管の遺伝子導入
Summary
These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.
Abstract
ステント内再狭窄は、広く冠動脈および末梢動脈の批判的に狭めセグメントを通じて再確立血流に使用されるステントベースの血管再生手順の主要な合併症を提示します。抗再狭窄性の活性を有する遺伝子の調節可能な放出が可能な血管内ステントは、現在、薬剤溶出ステントを使用するための代替戦略を提示することができる。典型的には、ベクターの物理的捕捉のために使用されるポリマーコーティングに関連付けられた過剰な炎症性応答を回避しながら、臨床翻訳を達成するために、遺伝子溶出ステントは、ステント固定化遺伝子ベクターの放出及び血管系の部位特異的な形質導入の予測可能な速度論を示さなければならない。本論文では、ビスフォスフォネート（PABT）が加水分解性架橋剤（HC）を介してステンレス鋼表面 – 修飾ポリアリルアミンするアデノウイルス粒子の可逆的結合に基づくステントとアデノウイルス遺伝子ベクターのコートレステザリングするための詳細な方法論を説明しています。の家族5〜50日の範囲内の鎖エステル加水分解の平均のt 1/2と二官能性（アミンおよびチオール反応性）HCは、ステントとベクターを連結するために使用した。ベクトル固定化手順は、一般的に9時間以内に行われ、いくつかのステップで構成されています。PABTの水溶液中の金属試料の1）インキュベーション（4時間）;トリス（2 – カルボキシエチル）ホスフィン（20分）でPABTに設置チオール基の2）の脱保護;ピリジルジチオ（PDT）グループ（2時間）で誘導体化ポリエチレンの試料を反応させて金属表面のチオール反応容量の3）拡張;ジチオスレイトール（10分）とのチオールへのPDT群の4）変換; HC（1時間）とアデノウイルスの5）の修正;サイズ排除カラムクロマトグラフィー（15分）、チオール化鋼表面上のチオール反応性アデノウイルス粒子（1時間）の7）の固定化によって修飾されたアデノウイルス粒子の6）精製。この技術は、ステントを越えて広い適用可能性を有している注入された異物をインターフェース細胞に対する基質媒介遺伝子送達を通じてそれらの生体適合性を強化するために、生体プロテーゼデバイスの表面工学を促進することによって。
Introduction
治療法として、遺伝子治療の有効性は、遺伝子治療ベクター1,2の乏しいターゲティング能力によって妨げられる。標的位置におけるトランスジーン発現の準治療レベルの適切なターゲティングの結果の欠如とは、ベクトルおよび符号化された治療用生成物4の両方に対する免疫応答をマウントするための担当者を含む非標的器官3へのベクターの広範な普及につながる5。一つの可能性は、形質導入の混乱を相殺し、標的化血液やリンパ液を介してそれらの自由普及を妨げる形で所望の位置に遺伝子ベクターを導入することで促進することを意味する。典型的には、このような努力は、物理的に目を捕捉することによって注射部位に一過性に維持遺伝子ベクターが可能であるフィブリン、コラーゲンまたはヒアルロン酸ハイドロゲルマトリックス6-10と混合したウイルスまたは非ウイルスベクターのいずれかを含む、局所的に注射可能な送達システムに依存しているポリマーネットワーク内のem。
ローカライズされた遺伝子治療のための別の一般的に受け入れられているパラダイムは、移植された補綴装置11,12の表面に遺伝子ベクターの固定化を利用する。常設医療用インプラント（血管、気管支、泌尿器及び胃腸ステント、ペースメーカー、人工関節、外科や婦人科のメッシュなどが 。）の患者13数千万で毎年使用されている。一般的に有効であるが、これらのデバイスは、不十分な現在の医療行為のために14〜17によって制御される合併症を起こしやすい。移植可能な人工デバイスは、ローカライズされた遺伝子治療の治療のためのプロキシ·プラットフォームとして機能するユニークな機会を提示する。薬物動態学的見地、インプラント/組織界面に遺伝子ベクターの高い局所濃度を両立し、theiの動態を遅らせる遺伝子ベクターの結果、比較的低い入力用量の医療用インプラントの表面誘導体からこの場所からのR撤廃する。長引く住宅目標とされた細胞集団による強化された取り込みの結果として、ベクトル·固定化は、遺伝子ベクターの拡散を最小限に抑えることができます。したがって非標的組織の不慮の接種が低減される。
（また、基板を介した遺伝子送達または固相遺伝子送達と呼ぶ）移植可能な生体材料上の遺伝子ベクターの表面テザリングは、両方の特定の（抗原-抗体18-20、アビジン-ビオチン21,22）を用いた細胞培養や動物実験で実装されました非特異的な23〜26（電荷、ファンデルワールス）相互作用。表面に過度に強い結合が標的細胞によりベクター内在化を排除するので、移植された装置の表面へのベクターの共有結合は、以前に非機能として考えられてきた。最近、この制限は、tetオペレーターとして使用自発的に加水分解性架橋剤の使用によって克服することができることが実証されたアデノウイルスベクター27,28のステントおよびキャプシドタンパク質の修飾された金属表面との間に彼女。さらに、 インビトロおよびインビボでの導入遺伝子発現のベクター放出速度および時間経過は、加水分解28の異なる動態を示す加水分解性架橋剤を用いて調節することができる。
本研究は、活性化金属表面にアデノウイルスベクターの可逆的共有結合のための詳細なプロトコルを提供し、ステント血管形成のラット頸動脈モデルにおいて培養平滑筋細胞および内皮細胞およびin vivoでのin vitroでのその後の伝達事象を研究するための有用な実験設定を導入。
Protocol
Representative Results
Discussion
提示されたプロトコルは、ステンレス鋼表面をコートレスするアデノウイルスベクターの可逆的結合によって達成基板を介した遺伝子送達のための運用方法について説明します。血管再狭窄のステントベースの遺伝子治療の特定の目的のために開発されているが、この技術は、生体材料、生物医学的インプラントおよび遺伝子治療の領域ではるかに広い用途を有する。
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have competing financial interests to disclose.
Materials
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP ) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
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