Trasferimento Gene vascolare da stent metallico superfici utilizzando Adenoviral Vettori Tethered tramite idrolizzabili Cross-linker
Summary
These studies report on reversible attachment of adenoviral gene vectors to coatless metal surfaces of stents and model mesh disks. Sustained release of transduction-competent viral particles contingent upon hydrolysis of cross-linkers used for vector immobilization results in a durable site-specific transgene expression in vascular cells and in stented arteries.
Abstract
In-stent restenosi presenta una complicazione maggiore di procedure di rivascolarizzazione basato stent-ampiamente utilizzati per ristabilire il flusso di sangue attraverso segmenti criticamente socchiusi delle arterie coronariche e periferiche. Stent endovascolari capaci di rilascio regolabile di geni con attività anti-restenotico può presentare una strategia alternativa di utilizzare attualmente stent a rilascio di farmaco. Per raggiungere traduzione clinica, gli stent a eluizione di geni devono presentare cinetica prevedibili del gene vettore di rilascio dello stent-immobilizzato e site-specific trasduzione dei vasi, evitando una eccessiva risposta infiammatoria tipicamente associati con i rivestimenti polimerici utilizzati per intrappolamento fisico del vettore. Questo documento descrive una metodologia dettagliata per il tethering senza cappotto di vettori genici adenovirali di stent sulla base di un legame reversibile delle particelle adenovirali per polyallylamine bifosfonati (PABT) -Modified superficie in acciaio inox con idrolizzabili reticolanti (HC). Una famiglia dibifunzionale HC (ammina e nonil fenolo tiolo-reattiva), con una t media mezzo di idrolisi in-catena compresa tra 5 e 50 giorni sono stati usati per collegare il vettore con lo stent. La procedura vettore immobilizzazione viene tipicamente effettuata entro 9 ore e comprende diverse fasi: 1) incubazione dei campioni di metallo in una soluzione acquosa di PABT (4 ore); 2) deprotezione dei gruppi tiolici installati in PABT con tris (2-carbossietil) fosfina (20 min); 3) l'espansione del tiolo capacità reattiva della superficie metallica facendo reagire i campioni con polietileneimmina derivatizzati con pyridyldithio (PDT) gruppi (2 ore); 4) la conversione di gruppi di PDT per tioli con ditiotreitolo (10 min); 5) modifiche di adenovirus con HC (1 ora); 6) la purificazione di particelle adenovirali modificate per dimensione-esclusione cromatografia su colonna (15 min) e 7) immobilizzazione di particelle adenovirali tiolo reattivo sulla superficie di acciaio tiolati (1 ora). Questa tecnica ha ampia applicabilità potenziale oltre stent,facilitando ingegneria delle superfici di dispositivi bioprotesi per migliorare la loro biocompatibilità attraverso la consegna del gene substrato mediata alle cellule di interfacciamento del materiale estraneo impiantato.
Introduction
L'efficacia della terapia genica come modalità terapeutica è ostacolata dalla capacità di targeting poveri di vettori di terapia genica 1,2. La mancanza di risultati di targeting propri in livelli sub-terapeutici di espressione del transgene nella posizione di destinazione e porta a una vasta diffusione dei vettori di organi non bersaglio 3, comprese quelle responsabili per il montaggio risposte immunitarie contro sia il vettore e codificati prodotto terapeutico 4, 5. Un potenziale significa compensare la promiscuità di trasduzione e di promuovere il targeting è quello di introdurre vettori genetici nella posizione desiderata in una forma che impedisce la loro libera diffusione attraverso il sangue e la linfa. Tipicamente, tali sforzi si basano su un sistema di consegna locale iniettabili comprendenti sia di vettori virali o non virali mescolati con fibrina, collagene o acido ialuronico matrici di idrogel 6-10 che sono in grado di transitoriamente sostengono vettori genetici nel sito di iniezione intrappolando fisicamente them in una rete polimerica.
Un altro paradigma generalmente accettato per la terapia genica localizzata utilizza immobilizzazione di vettori genetici sulla superficie dei dispositivi protesici impiantati 11,12. Impianti medici permanenti (endovascolari, bronchiali, stent urologici e gastrointestinali, pacemaker, articolazioni artificiali, maglie chirurgici e ginecologici, ecc.) Sono utilizzati ogni anno in decine di milioni di pazienti 13. Mentre generalmente efficace, questi dispositivi sono inclini a complicazioni che non sono adeguatamente controllati dalla pratiche mediche attuali 14-17. Dispositivi protesici impiantabili presentano un'opportunità unica per fungere da piattaforme di proxy per il trattamento localizzato la terapia genica. Dal punto di vista farmacocinetico, la superficie derivatizzazione di protesi mediche con dosi relativamente basse di ingresso di vettori genici risultati nel raggiungimento sia alte concentrazioni locali di vettori genetici sulla interfaccia impianto / tessuto e rallentare la cinetica di their eliminazione da questa posizione. Come conseguenza di residenza protratto e migliorato assorbimento da parte della popolazione di cellule bersaglio, vettore immobilizzazione minimizza propagazione del vettore gene. Così l'inoculazione involontaria di tessuti non bersaglio è ridotta.
Tethering superficie di vettori genici sui biomateriali impiantabili (anche definito come substrato mediata consegna del gene o la consegna del gene fase solida) è stato implementato in colture di cellule animali e gli esperimenti utilizzando sia specifica (antigene-anticorpo 18-20, avidina-biotina 21,22) e 23-26 (a pagamento, di van der Waals) interazioni non-specifiche. L'attacco covalente di vettori per la superficie del dispositivo impiantato è stata precedentemente considerata non funzionale fin troppo forti legami con la superficie precludono vettore internalizzazione dalle cellule bersaglio. Recentemente è stato dimostrato che questa limitazione può essere superata mediante l'uso di spontaneamente idrolizzabile reticolante usato come tetlei tra la superficie metallica modificata dello stent e del capside proteine del vettore adenovirale 27,28. Inoltre, il tasso di rilascio vettoriale e decorso di espressione del transgene in vitro e in vivo possono essere modulati con l'uso di idrolizzabili reticolanti espongono diverse cinetiche di idrolisi 28.
Il presente lavoro fornisce un protocollo dettagliato per il legame covalente reversibile di vettori adenovirali per superficie metallica attivato e introduce un setup sperimentale utile per lo studio successivi eventi di trasduzione in vitro nel muscolo liscio colto e cellule endoteliali e in vivo nel modello di ratto di stent carotideo angioplastica .
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato descrive un metodo operativo per substrato mediata consegna genico ottenuto attraverso l'attaccamento reversibile di vettori adenovirali per senza cappotto superfici in acciaio inox. Mentre sviluppato per lo scopo specifico della terapia genica basata stent-di restenosi vascolare, questa tecnica ha applicazioni molto più ampie nei settori dei biomateriali, protesi biomedicali e la terapia genica.
Anche se gli studi presentati sono esclusivamente utilizzato…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors do not have competing financial interests to disclose.
Materials
| 316 stainless steel mesh disks | Electon Microscopy Sciences | E200-SS | |
| Generic 304-grade stainless steel stents | Laserage | custom order | |
| AdeGFP | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV0504 | |
| AdLuc | University of Pennsylvania Vector Core | AD-5-PV1028 | |
| AdEMPTY | University of Pennsylvania Vector Core | A858 | |
| Cy3(NHS)2 | GE Healthcare | PA23000 | |
| Sepharose 6B | Sigma-Aldrich | 6B100-500ML | |
| UV 96-well plates | Costar | 3635 | |
| Fluorometry 96-well plates | Costar | 3915 | |
| Cell culture 96-well plates | Falcon | 353072 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP ) | Pierce Thermo Scientific | 20490 | |
| dithiothreitol (DTT) | Pierce Thermo Scientific | 20290 | |
| sulfo-LC-SPDP | Pierce Thermo Scientific | 21650 | |
| Spectrophotometer | Molecular Devices | SpectraMax 190 | |
| Spectrofluorometer | Molecular Devices | SpectraMax Gemini EM | |
| Orbital shaker incubator | VWR | 1575R | |
| Horizontal airflow oven | Shel Lab | 1350 FM | |
| Centra-CL2 centrifuge | International Equipment Company | 426 | |
| Digital vortex mixerer | Fisher Thermo Scientific | 02-215-370 | |
| Eclipse TE300 fluorescence microscope | Nikon | TE300 | |
| DC 500 CCD camera | Leica | DC-500 | |
| 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems | not available | |
| IVIS Spectrum bioluminescence station | Perkins-Elmer | not available | |
| EDTA dipotassium salt | Sigma-Aldrich | ED2P | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | Fisher Thermo Scientific | BP1600-100 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Dumont forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| A10 cell line | ATCC | CRL-1476 | |
| Bovine aortic endothelial cells | Lonza | BW-6002 | |
| Luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1Ge | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-136 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin solution | Gibco | 11540-122 | |
| DMEM, high glucose | Corning cellgro | 10-013-CV | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | |
| Power Sybr Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4367659 | |
| MicroAmp Optical 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems | 4360954 | |
| Cephazolin | Apotex | not available | |
| Loxicom (Meloxicam) | Norbrook | not available | |
| Heparin sodium | APP Pharmaceuticals | not available | |
| Ketavet (Ketamine) | VEDCO | not available | |
| Anased (Xylazine) | Lloid | not available | |
| Forane (Isoflurane) | Baxter | not available | |
| Curved Moria iris forceps | Fine Science tools | 11370-31 | |
| Curved extra-fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| Fine scissors – ToughCut | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14101-14 | |
| Vicryl suture (5-0) | Ethicon | J385 | |
| Suture thread (4/0 silk) | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| Michel suture clips | Fine Science Tools | 12040-02 | |
| Wound dilator (Lancaster eye specula) | KLS Martin | 34-149-07 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Michel suture clip applicator | Fine Science Tools | 112028-12 | |
| Insyte Autoguard 24G IV catheter | Beckton-Dickinson | 381412 | |
| 2F Fogarty catheter | Edwards Lifesciences | 120602F | |
| Teflon tubing | Vention | 041100BST | |
| PTA catheter | NuMed | custom order | |
| Gauze pads | Kendall Healthcare | 9024 | |
| Cotton applicators | Solon Manufacturing | WOD1003 | |
| Saline | Baxter | 281321 | |
| 10 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309604 | |
| 1 ml syringe (Luer-Lok) | Beckton-Dickinson | 309628 | |
| Clippers with #40 blade | Oster | 78005-314 | |
| Transpore surgical tape | 3M | MM 15271 | |
| Puralube vet ointment | Pharmaderm | not available |
References
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