Transfecter des cellules RAW264.7 avec un gène rapporteur de la luciférase
Summary
Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.
Abstract
Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.
Introduction
La transfection d'acides nucléiques dans des cellules a une application variée dans la recherche scientifique. Des exemples comprennent (1) des gènes rapporteurs pour étudier le rôle des éléments de différents gènes dans l'expression génique, (2) les plasmides d'expression de protéine de surexpriment la protéine d'intérêt, et (3) de petit ARN interférent régulent à la baisse l'expression du gène. En manipulant le niveau de certains gènes d'expression et de mesurer l'effet différentiel de ces manipulations, les chercheurs peuvent déduire les fonctions des gènes dans les systèmes biologiques choisis. Toutes les méthodes de transfection fournissent les mêmes efficacités de transfection, et même le même procédé de transfection ne transfecter pas tous les types cellulaires également une. Par conséquent, différents procédés de transfection ont été développés tel que le procédé au phosphate de calcium, DEAE-dextrane, transfection lipide cationique, la transfection de polymère non-lipide cationique, une électroporation, et nucléofection 2,3.
Transfection dans les macrophages est ESPEciellement difficile en raison du fait que les macrophages sont des phagocytes professionnels qui sont très sensibles à des matières étrangères, y compris les bactéries dérivées (méthyle) 4 ADN. L'introduction d'ADN étranger active la voie Toll-like récepteurs 9 (TLR9) conduisant à la production de cytokines et de 5,6 d'oxyde nitrique. Ces macrophages activés peuvent alors être moins sensibles au traitement que les chercheurs entendent examiner.
Notre laboratoire transfecte régulièrement la lignée cellulaire de macrophages RAW264.7 avec des gènes rapporteurs luciférase, et nous avons développé un protocole qui est suffisamment robuste pour activer le signal luciférase significativement plus élevé que de fond, mais aussi assez doux pour les macrophages de rester à leur état de repos. Les comportements des cellules transfectées ont été évaluées par un gène rapporteur de luciférase de luciole-porteuse de la région de promoteur de IκBζ (pGL3- IκBζ). IκBζ expression est régulée positivement par le composant lèvre de la paroi cellulaire bactérienneopolyssacharide (LPS) 7,8, et régulée à la baisse par la cytokine anti-inflammatoire, l'interleukine-10 (IL-10) 8. Pour tenir compte de la variation entre les puits transfection, nous avons co-transfecter un plasmide témoin contenant le gène de la luciférase de Renilla (par exemple, phRL-TK) à des fins de normalisation. Le protocole décrit est optimisée après l'essai de divers paramètres, y compris le moment de la transfection, le type de réactifs de transfection, des quantités de réactifs de transfection et de l'ADN de plasmide, ainsi que le rapport de réactif de transfection de l'ADN plasmidique. Les deux réactifs de transfection inclus dans ce protocole sont (1) un réactif de transfection à base de lipides et (2) une protéine / réactif de transfection à base de polyamine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici ne se concentre pas uniquement sur l'efficacité de transfection, mais vise à trouver un équilibre entre l'efficacité et la conservation des états physiologiques de cellules. Plus précisément, notre procédure réussit à minimiser la toxicité du réactif de transfection et de maximiser le signal luciférase.
Une étape critique dans le protocole est la santé des cellules. Envahi par la végétation des cultures ne sont pas appropriés pour la transfe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by Canadian Institutes for Health Research (CIHR) grant. STC holds a doctoral research award from the CIHR and the Michael Smith Foundation. EYS holds a CIHR scholarship. The CIHR Transplantation Training Program also provided graduate scholarships to STC, EYS and SS.
Materials
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5X Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
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