루시퍼 라제 리포터 유전자 RAW264.7 세포를 형질
Summary
Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.
Abstract
Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.
Introduction
세포의 핵산의 형질 과학 연구에서 다양한 응용 프로그램을 가지고있다. 예로는 (1) 리포터 유전자, 유전자 발현의 다른 유전자 요소의 역할을 연구하기 위해 (2) 단백 발현 플라스미드 관심 단백질을 과발현, 및 (3) 작은 RNA 간섭하는 유전자 발현을 하향 조절하기 위해 포함된다. 특정 유전자의 발현 량을 조작하는 등의 조작 차동 효과를 측정함으로써, 연구자들은 선택된 생물학적 시스템에서 유전자 기능을 추론 할 수있다. 모든 형질 전환 방법은 동일한 형질 전환 효율을 제공하고, 심지어 같은 형질 전환 방법은 균등 한 모든 유형의 세포를 형질 감염되지 않는다. 따라서, 다른 형질 전환 방법은 인산 칼슘 법, DEAE 덱스 트란, 양이온 성 지질 형질 감염, 비 양이온 성 지질 – 폴리머 형질 감염, 전기 천공, 및 2,3- nucleofection 등이 개발되었다.
대식 세포로 형질은 ESPE입니다cially 어려운 의한 대 식세포 (메틸화) DNA (4) 파생 된 박테리아를 포함하여 이물질에 매우 민감 전문 식세포가 있다는 사실에. 외래 DNA의 도입은 사이토 카인과 산화 질소 (5, 6)의 생산을 유도하는 수신자 같은 수용체 9 (TLR9) 경로를 활성화합니다. 이 활성화 된 대 식세포는 연구자가 조사하고자하는 치료에 덜 반응 할 수있다.
우리 연구소는 정기적으로 루시퍼 라제 리포터 유전자와 RAW264.7 대식 세포주를 transfects, 우리는 배경보다 훨씬 높은 루시 페라 제 신호가 충분히 강력 프로토콜을 개발하지만, 대 식세포가 휴식 상태로 유지하기에 충분한 또한 부드러운했다. 형질 감염된 세포의 행동은 IκBζ (pGL3- IκBζ)의 프로모터 영역을 은닉 반딧불이 루시퍼 라제 – 리포터 유전자에 의해 평가 하였다. IκBζ 발현 박테리아 세포벽 성분의 립에 의해 상향 조절되고opolyssacharide (LPS) 7,8, 및 항 염증성 사이토 카인에 의해 하향 조절, 인터루킨 10 (IL-10) 8. 웰 중에서 형질의 변화를 고려하기 위해 정규화 상업적 레 닐라 루시퍼 라제 유전자 (예 phRL-TK)를 포함하는 제어 플라스미드 – 형질 공동. 설명 프로토콜은 DNA 플라스미드의 다양한 형질 타이밍, 형질 전환 시약의 종류, 형질 전환 시약의 플라스미드 DNA의 양을 포함한 파라미터뿐만 아니라 형질 전환 시약의 비율 테스트 후 최적화된다. 이 프로토콜에 포함 된 두 개의 형질 전환 시약 (1) 지질 계 형질 전환 시약 및 (2) 단백질 / 폴리아민 계 형질 감염 시약이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜은 전적으로 형질 감염 효율에 집중하지 않고 여기에서 설명하지만, 세포의 생리 학적 상태의 효율과 보존 사이의 균형을 유지하는 것을 목표로하고있다. 구체적으로, 우리의 방법은 형질 전환 시약의 독성을 최소화하고 루시페라아제 신호를 최대화하는데 성공.
프로토콜의 하나의 중요한 단계는 셀의 상태이다. 자란 배양 그들의 생리 변화하고, 또한 셀 (10)의<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by Canadian Institutes for Health Research (CIHR) grant. STC holds a doctoral research award from the CIHR and the Michael Smith Foundation. EYS holds a CIHR scholarship. The CIHR Transplantation Training Program also provided graduate scholarships to STC, EYS and SS.
Materials
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5X Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336 (2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
