Transfizieren RAW264.7-Zellen mit einem Luciferase-Reportergen
Summary
Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.
Abstract
Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.
Introduction
Transfektion von Nukleinsäuren in Zellen hat eine vielfältige Anwendung in der wissenschaftlichen Forschung. Beispiele umfassen (1) Reportergene, die Rolle des anderen Gen Elemente Genexpression zu untersuchen, (2) Protein-Expressionsplasmiden, um das Protein von Interesse überexprimiert, und (3) kleine interferierende RNA die Genexpression herunterregulieren. Durch Manipulation des Expressionsniveaus bestimmter Gene und Messen des Differentialwirkung solcher Manipulationen können Forscher die Genfunktionen in den ausgewählten biologischen Systemen abzuleiten. Nicht alle Transfektionsverfahren die gleichen Transfektionseffizienzen und sogar die gleichen Transfektionsverfahren nicht alle Zelltypen ebenso 1 transfizieren. Daher verschiedene Transfektionsverfahren entwickelt worden, wie beispielsweise Calciumphosphat-Verfahren, DEAE-Dextran, kationische Lipid-Transfektion, kationische Lipid-Polymer nicht-Transfektion, Elektroporation und Nukleofektion 2,3.
Transfektion in Makrophagen ist ESPEsondere schwierig aufgrund der Tatsache, dass Makrophagen sind professionelle Phagozyten, die sehr empfindlich gegenüber Fremdmaterialien einschließlich Bakterien stammt (methyliert) DNA 4 sind. Einführung fremder DNA aktiviert den Toll-like Rezeptor 9 (TLR9) Weg führt zu der Produktion von Cytokinen und Stickstoffmonoxid 5,6. Diese aktivierten Makrophagen können dann weniger, die auf die Behandlung, die die Forscher beabsichtigen, zu untersuchen.
Unser Labor routinemäßig transfiziert den RAW264.7 Makrophagen-Zelllinie mit Luciferase-Reporter-Gene, und wir haben ein Protokoll, das robust genug ist, um die Luciferase-Signal deutlich höher als Hintergrund zu haben ist auch sanft genug für Makrophagen an ihren Ruhezustand bleiben entwickelt, aber. Die Verhaltensweisen der transfizierten Zellen wurden durch ein Glühwürmchen-Luciferase-Reporter-Gen beherbergen, das die Promotorregion des IκBζ (pGL3- IκBζ) bewertet. IκBζ Expression durch die Bakterienzellwand-Komponente Lippe hochreguliertopolyssacharide (LPS) 7,8 und durch die anti-inflammatorische Cytokin regulierte, Interleukin-10 (IL-10) 8. Um für die Transfektion Variation unter Brunnen Konto, kooperieren wir Transfektion ein Steuer Plasmid, das das Renilla-Luciferase-Gen (zB phRL-TK) zur Normalisierung Zwecke. Das beschriebene Protokoll wird nach der Prüfung verschiedener Parameter einschließlich Timing Transfektion Typ Transfektionsreagenzien Mengen von Transfektionsreagenzien und von Plasmid-DNA sowie Verhältnis von Transfektionsreagenz Plasmid-DNA optimiert. Die beiden Transfektionsreagenzien in diesem Protokoll enthalten sind (1) eine auf Lipid basierenden Transfektionsreagenz, und (2) ein Protein / Polyaminbasis Transfektionsreagenz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Protokoll nicht allein auf die Transfektionseffizienz zu konzentrieren, sondern zielt darauf ab, einen Ausgleich zwischen Effizienz und Erhaltung der physiologischen Zustände der Zellen zu schlagen. Insbesondere gelingt es unserem Verfahren bei der Minimierung der Toxizität von Transfektionsreagenz und Maximierung der Luciferase-Signal.
Ein kritischer Schritt im Protokoll ist die Gesundheit der Zellen. Wuchert Kulturen nicht geeignet sind für die Transfektion als ihr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by Canadian Institutes for Health Research (CIHR) grant. STC holds a doctoral research award from the CIHR and the Michael Smith Foundation. EYS holds a CIHR scholarship. The CIHR Transplantation Training Program also provided graduate scholarships to STC, EYS and SS.
Materials
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5X Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336 (2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
