Trasfettando Cellule RAW264.7 con luciferasi Reporter Gene
Summary
Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.
Abstract
Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.
Introduction
La trasfezione di acidi nucleici nelle cellule ha un'applicazione diversificata nella ricerca scientifica. Gli esempi includono (1) geni reporter per studiare il ruolo dei diversi elementi di gene espressione genica, (2) plasmidi di espressione proteica per overexpress la proteina di interesse, e (3) small interfering RNA downregulate espressione genica. Manipolando il livello di espressione di particolari geni e misurando l'effetto differenziale di tali manipolazioni, i ricercatori possono dedurre le funzioni geniche nei sistemi biologici scelti. Non tutti i metodi di trasfezione forniscono la stessa efficienza di trasfezione, e anche lo stesso metodo di trasfezione non trasfettare tutti i tipi cellulari parimenti 1. Quindi, diversi metodi di trasfezione sono stati sviluppati come metodo di fosfato di calcio, DEAE destrano, cationico lipidi trasfezione, cationico trasfezione polimero non lipidi, elettroporazione, e nucleofection 2,3.
Transfection in macrofagi è especialmente difficile a causa del fatto che i macrofagi sono fagociti professionali che sono molto sensibili a materiali estranei, tra cui i batteri derivati (metilato) DNA 4. Introduzione di DNA estraneo attiva la via Toll-like receptor 9 (TLR9) che porta alla produzione di citochine e ossido nitrico 5,6. Questi macrofagi attivati possono quindi essere meno sensibili al trattamento che i ricercatori intendono esaminare.
Il nostro laboratorio transfects regolarmente la linea cellulare di macrofagi RAW264.7 con geni reporter luciferasi, e abbiamo sviluppato un protocollo che è abbastanza robusto per avere segnale luciferasi significativamente superiore a quello di fondo, ma anche abbastanza delicato per i macrofagi di rimanere al loro stato di riposo. I comportamenti delle cellule trasfettate sono state valutate da un gene reporter luciferasi di lucciola-ospitare la regione del promotore di IκBζ (pGL3- IκBζ). Espressione IκBζ è upregulated dalla parete cellulare batterica componente labbroopolyssacharide (LPS) 7,8, e downregulated dalla citochina anti-infiammatoria, interleuchina-10 (IL-10) 8. Per tenere conto delle variazioni trasfezione tra pozzi, abbiamo co-trasfettare un plasmide di controllo che contiene il gene della luciferasi Renilla (ad esempio, phRL-TK) a fini di normalizzazione. Il protocollo descritto è ottimizzato dopo test vari parametri tra cui tempi di trasfezione, tipo di reagenti di trasfezione, quantità di reagenti e trasfezione di DNA plasmidico, così come rapporto di reagente di trasfezione di DNA plasmidico. I due reagenti di trasfezione compresi in questo protocollo sono (1) un reagente di trasfezione base lipidica e (2) una proteina / basato poliammina-trasfezione reagente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto non si concentra esclusivamente sulla efficienza di trasfezione, ma ha lo scopo di trovare un equilibrio tra efficienza e la conservazione degli stati fisiologici delle cellule. In particolare, la nostra procedura riesce a ridurre al minimo la tossicità di reagente di trasfezione e massimizzare il segnale luciferasi.
Un passo critico nel protocollo è la salute delle cellule. Culture Overgrown non sono adatti per la trasfezione come loro cambiamenti fisiologia e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by Canadian Institutes for Health Research (CIHR) grant. STC holds a doctoral research award from the CIHR and the Michael Smith Foundation. EYS holds a CIHR scholarship. The CIHR Transplantation Training Program also provided graduate scholarships to STC, EYS and SS.
Materials
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5X Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
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