Transfectar células RAW264.7 con un gen informador de luciferasa
Summary
Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.
Abstract
Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.
Introduction
La transfección de ácidos nucleicos en las células tiene una aplicación diversa en la investigación científica. Los ejemplos incluyen (1) genes indicadores para estudiar el papel de los diferentes elementos de genes en la expresión génica, (2) los plásmidos de expresión de proteínas que sobreexpresan la proteína de interés, y (3) pequeños ARN de interferencia para downregulate la expresión génica. Mediante la manipulación del nivel de expresión de genes particulares y midiendo el efecto diferencial de tales manipulaciones, los investigadores pueden deducir las funciones de los genes en los sistemas biológicos seleccionados. No todos los métodos de transfección proporcionan las mismas eficacias de transfección, e incluso el mismo método de transfección no transfectar todos los tipos celulares igualmente 1. Por lo tanto, los diferentes métodos de transfección se han desarrollado tal como el método de fosfato de calcio, DEAE dextrano, transfección de lípido catiónico, catiónicos transfección polímero no lípidos, electroporación, y nucleofection 2,3.
La transfección en macrófagos es ESPEcialmente difícil debido al hecho de que los macrófagos son fagocitos profesionales que son muy sensibles a materiales extraños, incluyendo bacterias derivados (metilado) DNA 4. Introducción de ADN extraño activa la vía Toll-like receptor 9 (TLR9) que conduce a la producción de citoquinas y 5,6 óxido nítrico. Estos macrófagos activados pueden entonces ser menos sensible al tratamiento que los investigadores pretenden estudiar.
Nuestro laboratorio transfecta rutinariamente la RAW264.7 línea celular de macrófagos con genes informadores de luciferasa, y hemos desarrollado un protocolo que es lo suficientemente robusta como para tener señal de luciferasa significativamente más alto que el fondo, pero también lo suficientemente suave para los macrófagos se mantengan en su estado de reposo. Los comportamientos de las células transfectadas fueron evaluados por un gen reportero de luciferasa de luciérnaga-albergar la región promotora del IκBζ (pGL3- IκBζ). IκBζ expresión está regulada por el labio componente de la pared celular bacterianaopolyssacharide (LPS) 7,8, y downregulated por la citoquina anti-inflamatoria, la interleucina-10 (IL-10) 8. Para tener en cuenta la variación de transfección entre pozos, co-transfectar un plásmido de control que contiene el gen de la luciferasa de Renilla (por ejemplo, phRL-TK) con fines de normalización. El protocolo descrito se optimiza después de probar varios parámetros incluyendo la sincronización de la transfección, el tipo de reactivos de transfección, las cantidades de reactivos de transfección y de ADN de plásmido, así como la relación de reactivo de transfección con el plásmido de ADN. Los dos reactivos de transfección incluidos en este protocolo son (1) un reactivo de transfección a base de lípidos y (2) a / reactivo de transfección a base de poliamina proteína.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí no sólo se centran en la eficiencia de la transfección, sino que pretende lograr un equilibrio entre la eficiencia y la conservación de los estados fisiológicos de las células. Específicamente, nuestro procedimiento tiene éxito en la reducción de la toxicidad del reactivo de transfección y la maximización de la señal de luciferasa.
Un paso crítico en el protocolo es la salud de las células. Culturas Cubierto de vegetación no son adecuados para la tra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by Canadian Institutes for Health Research (CIHR) grant. STC holds a doctoral research award from the CIHR and the Michael Smith Foundation. EYS holds a CIHR scholarship. The CIHR Transplantation Training Program also provided graduate scholarships to STC, EYS and SS.
Materials
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5X Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
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