Трансфекции клеток RAW264.7 с люциферазы гена
Summary
Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.
Abstract
Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.
Introduction
Трансфекция нуклеиновых кислот в клетках имеет разнообразный применение в научных исследованиях. Примеры включают в себя (1) гены репортер изучить роль различных элементов гена в экспрессии генов, (2) экспрессии белка плазмиды что экспрессия белка интерес, и (3) малых интерферирующих РНК подавляют экспрессию генов. Путем манипулирования уровня экспрессии отдельных генов и измерения перепада эффект таких манипуляций, исследователи могут вывести генные функции в выбранных биологических системах. Не все методы трансфекции обеспечивают те же эффективности трансфекции, и даже тот же метод трансфекции не трансфекции клеток всех типов в равной степени 1. Следовательно, различные методы трансфекции были разработаны такие как фосфат кальция методом, DEAE декстран, катионный липид трансфекции катионным, без липидов полимерной трансфекции, электропорации, и nucleofection 2,3.
Трансфекции в макрофагов ESPEбенно трудно из-за того, что макрофаги профессиональные фагоциты, которые очень чувствительны к посторонних материалов, включая бактерии, полученных (метилированный) ДНК 4. Введение чужеродной ДНК активирует Toll-подобный рецептор 9 (TLR9) путь, ведущий к продукции цитокинов и азотной окиси 5,6. Эти активированные макрофаги могут затем быть менее чувствителен к лечению, что исследователи намерены изучить.
Наша лаборатория постоянно transfects в RAW264.7 линию макрофагов клеток с люциферазных генов-репортеров, и мы разработали протокол, который достаточно прочный, чтобы люциферазы сигнал значительно выше, чем фон, но и достаточно мягкий для макрофагов оставаться на их состоянии покоя. Поведение трансфицированных клеток оценивали с помощью светлячка-репортерного гена люциферазы, несущим промоторную область IκBζ (pGL3- IκBζ). Выражение IκBζ активируется бактериальной компонента клеточной стенки губыopolyssacharide (ЛПС) 7,8, и подавляется в противовоспалительного цитокина, интерлейкин-10 (ИЛ-10) 8. Для учета изменения трансфекции среди скважин, мы сотрудничаем трансфекции управления плазмиды, содержащей ген люциферазы Renilla (например, phRL-TK) для целей нормализации. Протокол, описанный оптимизирован после тестирования различных параметров, включая сроки трансфекции, типа реагентов трансфекции, количества реагентов трансфекции и плазмидной ДНК, а также соотношение реагента для трансфекции плазмидной ДНК. Два трансфекции реагенты, включенные в этот протокол: (1) на основе липидов трансфекции реагента и (2) белок / полиамин на основе реагента для трансфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, не только сосредоточиться на эффективности трансфекции, но стремится найти баланс между эффективностью и сохранения физиологических состояний клеток. В частности, наша процедура удается свести к минимуму токсичность трансфекции реагента и максимизации лю?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by Canadian Institutes for Health Research (CIHR) grant. STC holds a doctoral research award from the CIHR and the Michael Smith Foundation. EYS holds a CIHR scholarship. The CIHR Transplantation Training Program also provided graduate scholarships to STC, EYS and SS.
Materials
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5X Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336 (2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
