Lusiferaz haberci geni ile RAW264.7 hücreleri transfekte
Summary
Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.
Abstract
Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.
Introduction
Hücrelerdeki nükleik asitlerin transfeksiyonu, bilimsel araştırma, çeşitli uygulama vardır. Örnekler (1) raportör genler, gen ekspresyonunda farklı gen elemanları rolünü incelemek için (2) protein ekspresyon plazmidleri ilgili proteini aşın ifade etmek üzere, (3) küçük bir müdahaleci RNA gen ifadesinin aşağı da içermektedir. Belirli genlerin ekspresyon seviyesi manipüle ve bu manipülasyonlar ayırıcı etkisini ölçerek, araştırmacılar, seçilen biyolojik sistemlerde gen işlevlerini ortaya çıkarabilir. Tüm transfeksiyon yöntemleri, aynı transfeksiyon verimliliği sağlar ve hatta aynı transfeksiyon yöntemi, aynı 1 tüm hücre tiplerinin transfeksiyonu etmez. Bu nedenle, farklı transfeksiyon yöntemleri, kalsiyum fosfat yöntemi, DEAE dekstran, katyonik lipit transfeksiyon, katyonik olmayan lipit polimer, transfeksiyon, elektroporasyon ve nucleofection 2,3 gibi geliştirilmiştir.
Makrofajlar içine Transfeksiyon bilhassa olduğunulikle zor dolayı makrofajlar (metıle) DNA 4 türetilen bakteriler de dahil olmak üzere yabancı maddelere karşı çok duyarlıdır profesyonel fagositler olmasından. Yabancı DNA'nın sokulması, sitokinler ve nitrik oksit 5,6 üretimine yol açan Toll-benzeri reseptör 9 (TLR9) yolunun aktive eder. Bu aktive makrofajlar daha sonra araştırmacılar incelemek niyetinde tedaviye daha az duyarlı olabilir.
Bizim laboratuvar rutin lusiferaz raportör genleri ile RAW264.7 makrofaj hücre hattı transfects ve biz arka planda önemli ölçüde daha yüksek lusiferaz sinyal yeterince sağlam bir protokol geliştirdi, ancak makrofajlar istirahat durumuna kalması için yeterli de nazik var. Transfekte edilmiş hücrelerin davranışları IκBζ (pGL3- IκBζ) promoter bölgesini barındıran bir ateş böceği lusiferaz raportör geni ile değerlendirildi. IκBζ ekspresyonu, bakteriyel hücre duvarı bileşeni, dudak ile üst-düzenlenmektediropolyssacharide (LPS) 7,8, ve anti-iltihabik sitokin ile baskılanmış, İnterlökin-10 (IL-10) 8. Kuyular arasındaki transfeksiyon varyasyon hesaba katmak için, normalleştirme amacıyla Renilla lusiferaz gen (örn phRL-TK) ihtiva eden bir kontrol plasmidi-transfekte co. Açıklanan protokol DNA plazmid çeşitli transfeksiyon zamanlaması, transfeksiyon reaktifleri tipi, transfeksiyon reaktifleri ve plasmid DNA miktar dahil olmak üzere parametreler, hem de transfeksiyon reaktifi oranı test edildikten sonra optimize edilir. Bu protokolde yer alan iki transfeksiyon reaktifleri (1), bir lipid-bazlı transfeksiyon reaktifi ve (2) bir protein / poliamin bazlı transfeksiyon reaktifi bulunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
protokol sadece transfeksiyon verimliliği odaklanmak değil Burada anlatılan, ancak hücrelerin fizyolojik devletlerin verimlilik ve korunması arasında bir denge amaçlamaktadır. Özellikle, bizim prosedür transfeksiyon reaktif toksisitesini en aza indirmek ve lusiferaz sinyali maksimize başarır.
Protokolünde bir kritik adım hücrelerinin sağlıktır. Büyümüş kültürler fizyolojik değişiklikleri ve aynı zamanda hücrelerin, 10 fenotip ve işlevini değiştirmek …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by Canadian Institutes for Health Research (CIHR) grant. STC holds a doctoral research award from the CIHR and the Michael Smith Foundation. EYS holds a CIHR scholarship. The CIHR Transplantation Training Program also provided graduate scholarships to STC, EYS and SS.
Materials
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5X Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336 (2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
