RAW264.7 transfecção de células com um gene repórter de luciferase

Summary

Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.

Abstract

Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency¹, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.

Introduction

A transfecção de ácidos nucleicos em células tem uma aplicação variada na pesquisa científica. Exemplos incluem (1) genes repórter para estudar o papel dos diferentes elementos do gene na expressão do gene, (2) expressão da proteína plasmídeos para sobre-expressar a proteína de interesse, e (3) pequeno ARN interferente para regular negativamente a expressão do gene. Ao manipular o nível de expressão de genes particulares e medindo o efeito diferencial de tais manipulações, os investigadores podem-se deduzir as funções de genes em sistemas biológicos seleccionados. Nem todos os métodos de transfecção fornecer a mesma eficiência de transfecção, e mesmo o mesmo método de transfecção não transfectar células igualmente todos os tipos ^1. Assim, diferentes métodos de transfecção têm sido desenvolvidos, tais como o método de fosfato de cálcio, DEAE dextrano, transfecção catiónica lípido, polímero catiónico transfecção não com lipidos, electroporação, e nucleofection ^2,3.

A transfecção em macrófagos é especialmente difícil devido ao fato de que os macrófagos são fagócitos profissionais que são muito sensíveis a materiais estranhos, incluindo as bactérias derivadas (desnaturado) de ADN ^4. A introdução de ADN estranho activa a via do receptor de tipo Toll 9 (TLR9) que conduz à produção de citocinas e ^5,6 de óxido nítrico. Estes macrófagos activados podem então ser menos sensível ao tratamento que os investigadores pretende examinar.

O nosso laboratório transfects rotineiramente a linha celular RAW264.7 de macrófagos com genes repórter da luciferase, e temos desenvolvido um protocolo que seja robusto o suficiente para que o sinal de luciferase significativamente mais elevada do que o fundo, mas também suficientemente suave para os macrófagos para permanecer no seu estado de repouso. Os comportamentos das células transfectadas foram avaliados por um gene repórter de luciferase de pirilampo-abrigando a região de promotor de IκBζ (pGL3- IκBζ). IκBζ expressão é regulada positivamente pelo lábio componente da parede celular bacterianaopolyssacharide (LPS) ^7,8, e regulados negativamente pela citocina anti-inflamatória, interleucina-10 (IL-10) ^8. Para ter em conta a variação entre os poços de transfecção, que co-transfectar um plasmídeo controlo que contém o gene da luciferase de Renilla (por exemplo, phRL-TK) para fins de normalização. O protocolo descrito foi optimizado depois de testar vários parâmetros, incluindo a temporização da transfecção, do tipo de reagentes de transfecção, as quantidades de reagentes de transfecção de ADN e o plasmídeo, bem como a relação de reagente de transfecção de plasmídeo de ADN. Os dois reagentes de transfecção incluídos neste protocolo são (1) um reagente de transfecção à base de lípidos e (2) um / reagente de transfecção à base de poliamina proteína.

Protocol

1. O plasmídeo de ADN A purificação Extrair ADN de plasmídeo utilizando um kit maxiprep de acordo com o protocolo do fabricante. Ressuspender o ADN do plasmídeo em 500 ul de tampão TE. Execute um fenol: clorofórmio: álcool isoamílico extração e precipitação com isopropanol para remover contaminantes bacterianos residuais. A presença de LPS interfere com transfecção 9. Adicionar 500 ul de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1, pH 8) para o ADN de plas…

Representative Results

A Figura 1 compara a eficiência da transfecção dos dois reagentes de transfecção em RAW264.7. O reagente à base de lípidos deu tipicamente cerca de 25% a taxa de transfecção, enquanto a transfecção com base em poliamina proteína / resultou em cerca de 5% de eficiência (Figura 1A). A diferença na eficiência de transfecção foi também observada em sinais de luciferase em células RAW264.7 transfectadas com o repórter do promotor pGL3-IκBζ (Figura 1B). …

Discussion

O protocolo descrito aqui não incidir exclusivamente sobre a eficiência de transfecção, mas tem o objetivo de estabelecer um equilíbrio entre eficiência e preservação dos estados fisiológicos das células. Especificamente, o nosso procedimento consegue minimizar a toxicidade do reagente de transfecção e maximização de sinal da luciferase.

Um passo essencial no protocolo é a saúde das células. Culturas crescidas não são adequados para a transfecção quanto suas alterações…

Materials

PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit	Life Technologies	K210007	Any maxiprep kit will work
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol	Life Technologies	15593-049	Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container.
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01	Warm in 37°C water bath before use.
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH30396.03	Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use.
Opti-MEM	Life Technologies	31985-070	Warm to at least room temperature before use.
XtremeGene HP DBA transfection reagent	Roche	6366236001	Warm to room temperature before use.
GeneJuice	EMD Millipore	70967	Warm to room temperature before use.
5X Passive Lysis Buffer	Promega	E1941	30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System
Dual Luciferase Reporter Assay System	Promega	E1910