ルシフェラーゼレポーター遺伝子でRAW264.7細胞をトランスフェクト
Summary
Transfection into the macrophage cell line, RAW264.7, is difficult due to the cell’s natural response against foreign materials. We described here a gentle yet robust procedure for transfecting luciferase reporter genes into RAW264.7 cells.
Abstract
Transfection of desired genetic materials into cells is an inevitable procedure in biomedical research studies. While numerous methods have been described, certain types of cells are resistant to many of these methods and yield low transfection efficiency1, potentially hindering research in those cell types. In this protocol, we present an optimized transfection procedure to introduce luciferase reporter genes as a plasmid DNA into the RAW264.7 macrophage cell line. Two different types of transfection reagents (lipid-based and polyamine-based) are described, and important notes are given throughout the protocol to ensure that the RAW264.7 cells are minimally altered by the transfection procedure and any experimental data obtained are the direct results of the experimental treatment. While transfection efficiency may not be higher compared to other transfection methods, the described procedure is robust enough for detecting luciferase signal in RAW264.7 without changing the physiological response of the cells to stimuli.
Introduction
細胞中の核酸のトランスフェクションは、科学研究における多様な用途を有します。例としては、遺伝子発現をダウンレギュレートする遺伝子発現の異なる遺伝子エレメントの役割を研究するために、（2）タンパク質発現プラスミドを、目的のタンパク質を過剰発現し、（3）低分子干渉RNA（1）レポーター遺伝子を含みます。特定の遺伝子の発現レベルを操作すると、そのような操作の差動効果を測定することによって、研究者は、選択された生物学的系における遺伝子の機能を推定することができます。必ずしもすべてのトランスフェクション方法は、同じトランスフェクション効率を提供し、さらに同一のトランスフェクション法は、1に等しく、すべての細胞型をトランスフェクトしません。従って、異なるトランスフェクション方法は、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン、カチオン性脂質トランスフェクション、カチオン性非脂質性ポリマートランスフェクション、エレクトロポレーション、およびヌクレオ2,3として開発されてきました。
マクロファージへのトランスフェクションはESPEですによるマクロファージが（メチル化）DNA 4由来の細菌を含む異物に非常に敏感であるプロの食細胞であるという事実にインターネット上の下記URLで難しいです。外来DNAの導入は、サイトカインおよび一酸化窒素5,6の産生をもたらすToll様受容体9（TLR9）経路を活性化します。これらの活性化マクロファージはその後、研究者が検討する予定治療にあまり応答することができます。
私たちの研究室では、日常的に、ルシフェラーゼレポーター遺伝子とのRAW264.7マクロファージ細胞株をトランスフェクトし、我々は、バックグラウンドよりも有意に高いルシフェラーゼシグナルを有するのに十分な堅牢であるプロトコルを開発するだけでなく、それらの休止状態のままにするマクロファージのための十分な穏やかいます。トランスフェクトされた細胞の挙動をIκBζ（pGL3-IκBζ）のプロモーター領域を保有するホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子で評価しました。 IκBζ発現は、細菌の細胞壁成分のリップによってアップレギュレートされますopolyssacharide（LPS）7,8、および抗炎症性サイトカインによって下方制御、インターロイキン10（IL-10）8。井戸の中で、トランスフェクションの変動を考慮するために、我々は、正規化のためにウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子（ 例えば、phRL-TK）を含む対照プラスミドを同時トランスフェクト。記述されたプロトコルは、トランスフェクションのタイミング、トランスフェクション試薬の種類、トランスフェクション試薬のプラスミドDNAの量、ならびにプラスミドDNAのトランスフェクション試薬の比を含む種々のパラメータをテストした後に最適化されます。このプロトコルに含まれる2つのトランスフェクション試薬（1）脂質ベースのトランスフェクション試薬と、（2）タンパク質/ポリアミン系トランスフェクション試薬です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、単独でトランスフェクション効率に焦点を当てたが、細胞の生理的状態の効率と保全のバランスを取ることを目的としません。具体的には、私たちの手順は、トランスフェクション試薬の毒性を最小化し、ルシフェラーゼシグナルを最大化することに成功しています。
プロトコルにおける一つの重要なステップは、細胞の健康状態です。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was funded by Canadian Institutes for Health Research (CIHR) grant. STC holds a doctoral research award from the CIHR and the Michael Smith Foundation. EYS holds a CIHR scholarship. The CIHR Transplantation Training Program also provided graduate scholarships to STC, EYS and SS.
Materials
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37°C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56°C water bath for 45 minutes before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5X Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336 (2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
