Olfactorische gedrag getest door Computer Tracking Of<em> Drosophila</em> In een vier-kwadrant olfactometer
Summary
We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.
Abstract
Een belangrijke uitdaging in de neurobiologie is te begrijpen hoe neurale circuits functioneren passende dier gedrag leiden. Drosophila melanogaster is een uitstekend modelsysteem voor deze onderzoeken als gevolg van de complexe gedragingen, krachtige genetische technieken, en compact zenuwstelsel. Laboratorium behavioral assays zijn lang gebruikt met Drosophila om de eigenschappen van de natuurlijke omgeving te simuleren en bestuderen van de neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan de bijbehorende gedrag (bijv phototaxis, chemotaxis, zintuiglijke leren en geheugen) 1-3. Met de recente beschikbaarheid van grote collecties van transgene Drosophila lijnen die specifieke neurale subsets label, hebben gedragsproblemen assays genomen op een prominente rol voor neuronen te koppelen aan gedrag 4-11. Veelzijdig en reproduceerbare paradigma, tezamen met de onderliggende computationele routines voor gegevensanalyse, onontbeerlijk voor snelle tests kandidaat vlieglijnen diverse genotypes. Bijzonder geschikt zijn opstellingen die flexibel in het aantal geteste dieren, duur van experimenten en de aard van de aangeboden stimuli. De test van keuze ook genereren reproduceerbare data die gemakkelijk te verkrijgen en te analyseren. Hier presenteren wij een gedetailleerde beschrijving van een systeem en protocol voor het testen gedragsreacties van Drosophila vliegt in een grote vier-veld arena. De opstelling wordt hier gebruikt om responsen van vliegen naar een olfactorische stimulus testen; echter, de zelfde opstelling worden gewijzigd om meervoudige geur, visuele of optogenetic stimuli of een combinatie van deze testen. De olfactometer setup registreert de activiteit van vliegen bevolking te reageren op geuren, en computationele analysemethoden worden toegepast op fly gedrag te kwantificeren. De verzamelde gegevens worden geanalyseerd om een snelle uitlezing van een experimenteel run, die essentieel is voor een efficiënte verzamelen van gegevens en het optimaliseren van de experimentele omstandigheden te krijgen.
Introduction
Het vermogen zich aan te passen en te reageren op de externe omgeving is van cruciaal belang voor het voortbestaan van alle dieren. Een dier moet gevaren te vermijden, op zoek gaan naar voedsel en vind stuurlieden, en te leren van eerdere ervaringen. Sensorische systemen functioneren van verschillende stimuli, zoals visuele, chemische en mechanosensorische ontvangen en deze signalen naar het centrale zenuwstelsel worden uitgelegd en gedecodeerd. De hersenen stuurt vervolgens de juiste motor gedrag op basis van de waargenomen omgeving, zoals op zoek naar voedsel of ontsnappen uit een roofdier. Begrijpen hoe sensorische systemen detecteren de buitenwereld, en hoe de hersenen decodeert en stuurt beslissingen, is een grote uitdaging in de neurobiologie.
Drosophila melanogaster is een krachtig modelsysteem voor het onderzoeken hoe neurale circuits gids gedrag. Behalve dat eenvoudig en goedkoop te handhaven, Drosophila vertonen veel verschillende, complexe stereotype gedrag, maar doen dit met een compact zenuwstelsel van ongeveer 100.000 neuronen. Krachtige genetische technieken bestaan voor het manipuleren van het Drosophila genoom en duizenden transgene lijnen werden gegenereerd die selectief en reproduceerbaar dezelfde subsets van neuronen 10-13 labelen. Deze transgene lijnen kunnen worden gebruikt om selectief de activiteit van de gelabelde neuronen (activeren of remmen) te manipuleren en deze manipulaties kunnen worden gebruikt om te onderzoeken hoe de neurale helpfuncties gedrag.
Meerdere gedrags assays ontwikkeld voor het bestuderen van verschillende Drosophila gedrag. Drosophila, zoals veel dieren gebruiken hun reukzin voor het geleiden vele gedragskeuzes, zoals het vinden van voedsel, partners vinden, en het vermijden van gevaar. Reukzin is daarom een goede sensorische systeem voor het onderzoeken welke externe stimuli worden gedetecteerd en geïnterpreteerd door het zenuwstelsel van een dier om de juiste keuzes te leiden. Aldus worden een aantal testen ontwikkeld voor ONDERZOEKTing larven en volwassen olfactorische gedrag. Traditioneel, olfactorische gedrag in Drosophila werden bepaald door twee keuze T-doolhof paradigma, dat kan worden gebruikt voor het bepalen aangeboren en aangeleerd gedrag olfactorische 3. In deze assay worden ongeveer 50 vliegen de keuze tussen twee buizen: één buis bevat de betrokken geur en de andere bevat een sturing geurstof (meestal de geur oplosmiddel). De vliegen krijgen een bepaalde tijd om een keuze te maken, en dan is het aantal vliegen die in de verschillende kamers worden geteld. Hoewel de T-doolhof is een eenvoudige test voor veel experimenten, zijn er verschillende beperkingen. Zo worden olfactorische gedrag gemeten op één tijdstip, en andere keuzes vóór dit tijdstip worden verwijderd. Ook de individuele gedrag van de vliegen in de populatie worden verwaarloosd. Bovendien, de T-doolhof vereist handmatige telling van vliegen, die fouten kunnen voeren. Tot slot, aangezien er slechts twee keuzen gemeten, ditvermindert de statistische power vaak nodig om subtiele gedragsveranderingen te detecteren. Een alternatief voor een twee-choice T-doolhof is een vier-kwadrant (vier-veld) olfactometer 14-18. In deze test, dieren verkennen een arena waarin elk van de vier hoeken van de arena is gevuld met een potentiële bron van geodoriseerde lucht. De arena heeft een gebobbeld stervorm om de vorming van vier experimenteel gedefinieerde geur kwadranten te maximaliseren. Indien een geur wordt geleverd in een van de hoeken dan enkel is opgenomen, dat één kwadrant. Het gedrag van de dieren kan worden gevolgd als ze binnenkomen en verlaten van de geur kwadrant, en gemakkelijk in vergelijking met hun gedrag in de drie controle kwadranten. De vier-kwadrant olfactometer assay dus dossiers ruimtelijke en temporele behavioral reactie op de geur stimuli over een groot experimenteel arena.
De vier kwadranten olfactometer werd ontwikkeld door Pettersson et al. 15 en Vet et al. 17 aan de ol onderzoekenfabriek gedragsreacties van individuele parasitaire wespen. Faucher et al. 18 en Semmelhack en Wang 16 aangepast aan de setup van de olfactorische reacties van individuele Drosophila bewaken. De vier-kwadrant olfactometer is even gevoelig voor aantrekkende en afstotende reacties, waardoor een groot aantal testen geurstoffen en condities. -Maat geschreven fly tracking software, ontwikkeld door Alex Katsov 19 en momenteel onderhouden door Julian Brown (beschreven in Materials), introduceerde extra voordelen aan meer recente implementaties van de vier-kwadrant olfactometer 14,20-23. Het is nu mogelijk om te testen op 100 vliegen tegelijkertijd aan hoge spatiale (27,5 pixels / cm) en temporele (30 frames per seconde) resolutie, die toelaat extraheren verschillende parameters, zoals positie, snelheid en versnelling van vliegen op elk tijdstip. Dit maakt onderzoek naar de dynamiek van gedragsreacties de vliegen om geuren 20 </sup>. Opgemerkt zij echter dat de identiteit van afzonderlijke vliegen binnen de bevolking gedurende de gehele periode volgen niet wordt gehandhaafd. In plaats daarvan wordt elk fly spoor opgenomen zolang als twee sporen vliegen niet snijden. Op welk moment worden nieuwe nummers toegewezen nadat de vliegen uiteen. Door het opnemen van andere video vastleggen software (gespecificeerd in tabel Materials), dezelfde configuratie maakt flexibel volgen periodes kunnen worden gebruikt om vliegen spoor tot 24 uur door middel van beelden met een lagere framesnelheid. Deze optie werd gebruikt voor het leggen van eieren gedrag van vliegen te bestuderen en hun lichaamshoudingen vergelijken met ovipositional voorkeuren 14. De vier-veld olfactometer kan ook worden gebruikt om reacties te bestuderen multimodale (bijvoorbeeld geur en visuele) stimuli, of optogenetic 9 of 21 thermogenetische stimulatie combineren met presentaties van sensorische stimuli. Bovendien is de hoge temporele resolutie kan extractie van trajecten for elke individuele fly in het ensemble dataset. Daarom is de methode maakt het mogelijk onderzoek naar olfactorische-begeleide bevolking gedrag en ook de individuele sociale interacties. De opbrengst van deze analysegegevens zijn robuust en zeer reproduceerbaar, waardoor het gebruik van de vier-veld olfactometer gedrags- schermen.
We beschrijven hier de setup assemblage voor een vier-kwadrant olfactometer. We verder het gebruik ervan bij het bepalen olfactorische aantrekkingskracht als reactie op appelazijn en afstoting in reactie op sterk geconcentreerde ethylpropionaat tonen. Tenslotte beschrijven we en geven typisch code voor de analyse van de geregistreerde vlieg trackinggegevens.
Protocol
Representative Results
Discussion
De vier-veld olfactometer beschreven is een veelzijdig gedragssysteem voor het bestuderen van de olfactorische reactie van grote populaties van wildtype en mutante Drosophila vliegt. Elk experiment duurt ~ 1 uur (inclusief setup, experimentele runs en schoonmaak), en 4-6 experimenten kunnen routinematig elke dag worden uitgevoerd. Een typische test met behulp 40-50 vliegen gedurende 5 minuten genereert ongeveer 450.000 bijgehouden gegevenspunten voor analyse. De beschreven configuratie kan ook worden gebruikt, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Terry Shelley for manufacturing the fly arena and the light-tight enclosure, Liz Marr for help with fly stock maintenance, and Xiaojing Gao and Junjie Luo for help with the Matlab code used for data analysis. We thank Johan Lundström at the Monell Chemical Senses Center for demonstrating his odor delivery setup. This work was supported by grants from the Whitehall Foundation (CJP) and NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).
Materials
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150-mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 01-18 | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2oz; 60ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12"x12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9"x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture 2.2 software | The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/) | ||
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
References
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
- Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
- Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
- Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
- Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
- Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580 (2014).
- Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
- Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
- Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
- Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
- Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
- Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
- Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
- Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
- Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
- Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
- Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986 (2015).
- Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
- Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
- Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
- Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
- Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
- Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
- Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
- Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction – The Flywalk. Sci Rep. 2, 361 (2012).
- Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
- Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
- Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).
